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牡丹肽 技术方法汇总三篇

2020-10-29 22:00:12

  牡丹肽 1篇:

  一种牡丹肽硒螯合物的制备方法

  技术领域

  本发明涉及植物提取物领域,具体涉及一种牡丹肽硒螯合物的制备方法。

  技术背景

  牡丹是毛莨科、芍药属植物,有“国色天香”之称。经牡丹籽开发的牡丹籽油是集营养和保健为一体的天然无公害食品。而压榨牡丹籽油的副产品之一的牡丹籽粕蛋白含量达到19.03%。

  蛋白质是食品的重要组成成分,蛋白质经酶解后得到蛋白肽,其功能特性和生物学特性,与原有蛋白质有较大差别,如酶解后可改善蛋白质的溶解性,乳化性,起泡性等功能特性,我国每年都有大量制油后的牡丹籽粕产物,可以得到大量的牡丹蛋白,因此,如何高效率、低成本得到满足生活所需的牡丹蛋白肽,是现在的研究热点。

  微量元素是人体必需的营养物质,但以无机盐形式存在的微量元素在生物机体内利用率不超过20%。而小肽由于其肽链短,在体内具有吸收利用率高、排泄率低、消化稳定性好等特点。

  目前的蛋白肽硒螯合物,一般存在生产纯度不高,而且对硒的螯合量也不高。

  发明内容

  本发明的目的在于克服现有技术中的问题,提供了一种牡丹肽硒螯合物的制备方法。

  本发明的目的通过以下技术方案予以实现:

  一种牡丹肽硒螯合物的制备方法,包括以下步骤:S1牡丹籽蛋白肽制备;S2用去离子水将制备的牡丹籽蛋白肽配置成质量分数为9%~14%的溶液; S3加入0.8~1.2mmol/L的亚硒酸盐混合均匀,调节溶液的pH为5~5.5,在55~60℃条件下搅拌50~90min;S4加入混合液体积2~3倍的乙醇与叔丁醇的混合液,乙醇与叔丁醇的体积比为1:3~5,静置24~36h,保留沉淀,于35~40℃真空干燥。

  一种牡丹肽硒螯合物的制备方法,采用亚硒酸盐作为硒源与牡丹籽蛋白肽进行螯合。在pH为5~5.5的范围内,得到的硒螯合物的产率更高。采用乙醇和叔丁醇按照1:3~5更有利于硒螯合蛋白肽的析出。

  优选地,所述步骤S3中溶液的pH为5.2。

  优选地,所述步骤S4中乙醇与叔丁醇的体积比为1:4。

  优选地,所述步骤S1牡丹籽蛋白肽的制备,包括以下步骤:S11从牡丹籽粕提取牡丹蛋白;S12用超临界二氧化碳对牡丹蛋白进行萃取;S13取牡丹蛋白,按照质量比为1:20~25加入蒸馏水溶解牡丹蛋白,调节温度在37~40℃,调节溶液的pH为8~10;S14 加入牡丹蛋白质量的2%~3%,比例为1:2~2.5的菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶,酶解时间30~50min;S15将酶解后的溶液升温到100℃,保持10~15min,然后再恢复到50~55℃;S16加入牡丹蛋白质量的6%~8%,比例为1:3~7的木瓜蛋白酶和内肽酶Glu-C,酶解时间1~1.5h,然后迅速煮沸;S17将溶液离心分离,将上清液冻干。

  优选地,所述步骤S14中菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的比例为1:2.1。

  优选地,所述步骤S14中酶解时间为40min。

  优选地,所述步骤S16中木瓜蛋白酶和内肽酶Glu-C的比例为1:4.2。

  优选地,所述步骤S16中酶解时间为1.4h。

  与现有技术相比本发明具有以下技术效果:

  一种牡丹肽硒螯合物的制备方法,采用牡丹肽与无机硒进行螯合,比其他蛋白肽与硒螯合相比,牡丹肽的螯合率更高。采用合理的pH提高了牡丹肽硒螯合物的产率。采用乙醇和叔丁醇进行醇析,牡丹肽硒螯合物的更容易析出。

  具体实施方式

  为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面结合具体实施例和对比例将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式,都属于本发明所保护的范围。

  除特殊说明,本实施例、对比例以及实验例中所用的设备均为常规实验设备,所用的试剂均为市售可得。

  实施例1

  一种牡丹肽硒螯合物的制备方法,包括以下步骤:

  S1牡丹籽蛋白肽制备;

  S2用去离子水将制备的牡丹籽蛋白肽配置成质量分数为9%的溶液;

  S3加入0.8mmol/L的亚硒酸盐混合均匀,调节溶液的pH为5,在55℃条件下搅拌50min;

  S4加入混合液体积2倍的乙醇与叔丁醇的混合液,乙醇与叔丁醇的体积比为1:3,静置24h,保留沉淀,于35℃真空干燥。

  上述步骤S1牡丹籽蛋白肽的制备,包括以下步骤:

  S11从牡丹籽粕提取牡丹蛋白;

  S12用超临界二氧化碳对牡丹蛋白进行萃取;

  S13取牡丹蛋白,按照质量比为1:20加入蒸馏水溶解牡丹蛋白,调节温度在37℃,调节溶液的pH为8;

  S14加入牡丹蛋白质量的2%,比例为1:2的菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶,酶解时间30min;

  S15将酶解后的溶液升温到100℃,保持10min,然后再恢复到50℃;

  S16再加入牡丹蛋白质量的6%,比例为1:3的木瓜蛋白酶和内肽酶Glu-C,酶解时间1h,然后迅速煮沸;

  S17将溶液离心分离,将上清液冻干。

  实施例2

  一种牡丹肽硒螯合物的制备方法,包括以下步骤:

  S1牡丹籽蛋白肽制备;

  S2用去离子水将制备的牡丹籽蛋白肽配置成质量分数为14%的溶液;

  S3加入1.2mmol/L的亚硒酸盐混合均匀,调节溶液的pH为5.5,在55℃条件下搅拌90min;

  S4加入混合液体积3倍的乙醇与叔丁醇的混合液,乙醇与叔丁醇的体积比为1:5,静置36h,保留沉淀,于40℃真空干燥。

  上述步骤S1牡丹籽蛋白肽的制备,包括以下步骤:

  S11从牡丹籽粕提取牡丹蛋白;

  S12用超临界二氧化碳对牡丹蛋白进行萃取;

  S13取牡丹蛋白,按照质量比为1:20加入蒸馏水溶解牡丹蛋白,调节温度在40℃,调节溶液的pH为10;

  S14加入牡丹蛋白质量的3%,比例为1:2.5的菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶,酶解时间50min;

  S15将酶解后的溶液升温到100℃,保持15min,然后再恢复到55℃;

  S16再加入牡丹蛋白质量的8%,比例为1:7的木瓜蛋白酶和内肽酶Glu-C,酶解时间1.5h,然后迅速煮沸;

  S17将溶液离心分离,将上清液冻干。

  实施例3

  一种牡丹肽硒螯合物的制备方法,包括以下步骤:

  S1牡丹籽蛋白肽制备;

  S2用去离子水将制备的牡丹籽蛋白肽配置成质量分数为10%的溶液;

  S3加入0.9mmol/L的亚硒酸盐混合均匀,调节溶液的pH为5.2,在55℃条件下搅拌60min;

  S4加入混合液体积2倍的乙醇与叔丁醇的混合液,乙醇与叔丁醇的体积比为1:4,静置24h,保留沉淀,于37℃真空干燥。

  上述步骤S1牡丹籽蛋白肽的制备,包括以下步骤:

  S11从牡丹籽粕提取牡丹蛋白;

  S12用超临界二氧化碳对牡丹蛋白进行萃取;

  S13取牡丹蛋白,按照质量比为1:20加入蒸馏水溶解牡丹蛋白,调节温度在38℃,调节溶液的pH为8;

  S14加入牡丹蛋白质量的2%,比例为1:2.1的菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶,酶解时间40min;

  S15将酶解后的溶液升温到100℃,保持10min,然后再恢复到50℃;

  S16再加入牡丹蛋白质量的6%,比例为1:4.2的木瓜蛋白酶和内肽酶Glu-C,酶解时间1.4h,然后迅速煮沸;

  S17将溶液离心分离,将上清液冻干。

  对比例1

  一种玉米肽硒螯合物的制备方法,包括以下步骤:S1玉米蛋白肽制备;S2用去离子水将制备的玉米蛋白肽用去离子水配置成质量分数为10%的溶液; S3加入0.9mmol/L的亚硒酸盐混合均匀,调节溶液的pH为5.2,在55℃条件下搅拌60min;S4加入混合液体积2倍的乙醇与叔丁醇的混合液,乙醇与叔丁醇的体积比为1:4,静置24h,保留沉淀,于37℃真空干燥。

  与实施例3相比,本对比例采用玉米肽替代牡丹肽。

  对比例2

  一种牡丹肽硒螯合物的制备方法,包括以下步骤:S1牡丹籽蛋白肽制备;S2用去离子水将制备的牡丹籽蛋白肽配置成质量分数为10%的溶液; S3加入0.9mmol/L的亚硒酸盐混合均匀,调节溶液的pH为4,在55℃条件下搅拌60min;S4加入混合液体积2倍的乙醇与叔丁醇的混合液,乙醇与叔丁醇的体积比为1:4,静置24h,保留沉淀,于37℃真空干燥。

  上述步骤S1牡丹籽蛋白肽的制备,包括以下步骤:S11从牡丹籽粕提取牡丹蛋白;S12用超临界二氧化碳对牡丹蛋白进行萃取;S13取牡丹蛋白,按照质量比为1:20加入蒸馏水溶解牡丹蛋白,调节温度在38℃,调节溶液的pH为8;S14加入牡丹蛋白质量的2%,比例为1:2.1的菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶,酶解时间40min;S15将酶解后的溶液升温到100℃,保持10min,然后再恢复到50℃;S16再加入牡丹蛋白质量的6%,比例为1:4.2的木瓜蛋白酶和内肽酶Glu-C,酶解时间1.4h,然后迅速煮沸;S17将溶液离心分离,将上清液冻干。

  与实施例3相比,本对比例步骤S3中pH低于本发明方案中步骤S3的pH范围。

  对比例3

  一种牡丹肽硒螯合物的制备方法,包括以下步骤:

  S1牡丹籽蛋白肽制备;

  S2用去离子水将制备得到的牡丹籽蛋白肽配置成质量分数为10%的溶液;

  S3加入0.9mmol/L的亚硒酸盐混合均匀,调节溶液的pH为6,在55℃条件下搅拌60min;

  S4加入混合液体积2倍的乙醇与叔丁醇的混合液,乙醇与叔丁醇的体积比为1:4,静置24h,保留沉淀,于37℃真空干燥。

  上述步骤S1牡丹籽蛋白肽的制备,包括以下步骤:

  S11从牡丹籽粕提取牡丹蛋白;

  S12用超临界二氧化碳对牡丹蛋白进行萃取;

  S13取牡丹蛋白,按照质量比为1:20加入蒸馏水溶解牡丹蛋白,调节温度在38℃,调节溶液的pH为8;

  S14加入牡丹蛋白质量的2%,比例为1:2.1的菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶,酶解时间40min;S15将酶解后的溶液升温到100℃,保持10min,然后再恢复到50℃;S16再加入牡丹蛋白质量的6%,比例为1:4.2的木瓜蛋白酶和内肽酶Glu-C,酶解时间1.4h,然后迅速煮沸;S17将溶液离心分离,将上清液冻干。

  与实施例3相比,本对比例步骤S3中pH高于本发明方案中步骤S3的pH范围。

  对比例4

  一种牡丹肽硒螯合物的制备方法,包括以下步骤:

  S1牡丹籽蛋白肽制备;

  S2离子水将制备的牡丹籽蛋白肽用去配置成质量分数为10%的溶液;

  S3加入0.9mmol/L的亚硒酸盐混合均匀,调节溶液的pH为5.2,在55℃条件下搅拌60min;

  S4在步骤S3中加入混合液体积2倍的乙醇,静置24h,保留沉淀,于37℃真空干燥。

  上述步骤S1牡丹籽蛋白肽的制备,包括以下步骤:

  S11从牡丹籽粕提取牡丹蛋白;

  S12用超临界二氧化碳对得到的牡丹蛋白进行萃取;

  S13取牡丹蛋白,按照质量比为1:20加入蒸馏水溶解牡丹蛋白,调节温度在38℃,调节溶液的pH为8;

  S14加入牡丹蛋白质量的2%,比例为1:2.1的菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶,酶解时间40min;

  S15将酶解后的溶液升温到100℃,保持10min,然后再恢复到50℃;

  S16再加入牡丹蛋白质量的6%,比例为1:4.2的木瓜蛋白酶和内肽酶Glu-C,酶解时间1.4h,然后迅速煮沸;S17将溶液离心分离,将上清液冻干。

  与实施例3相比,本对比例步骤S4中只加入了乙醇。

  对比例5

  一种牡丹肽硒螯合物的制备方法,包括以下步骤:

  S1牡丹籽蛋白肽制备;

  S2用去离子水将制备的牡丹籽蛋白肽配置成质量分数为10%的溶液;

  S3溶液中加入0.9mmol/L的亚硒酸盐混合均匀,调节溶液的pH为5.2,在55℃条件下搅拌60min;

  S4加入混合液体积2倍的叔丁醇的混合液,静置24h,保留沉淀,于37℃真空干燥。

  上述步骤S1牡丹籽蛋白肽的制备,包括以下步骤:

  S11从牡丹籽粕提取牡丹蛋白;

  S12用超临界二氧化碳对得到的牡丹蛋白进行萃取;

  S13取牡丹蛋白,按照质量比为1:20加入蒸馏水溶解牡丹蛋白,调节温度在38℃,调节溶液的pH为8;

  S14加入牡丹蛋白质量的2%,比例为1:2.1的菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶,酶解时间40min;

  S15将酶解后的溶液升温到100℃,保持10min,然后再恢复到50℃;

  S16加入牡丹蛋白质量的6%,比例为1:4.2的木瓜蛋白酶和内肽酶Glu-C,酶解时间1.4h,然后迅速煮沸;

  S17将溶液离心分离,将上清液冻干。

  与实施例3相比,本发明步骤S4只加入了叔丁醇。

  对比例6

  一种牡丹肽硒螯合物的制备方法,包括以下步骤:

  S1牡丹籽蛋白肽制备;

  S2将用去离子水将牡丹籽蛋白肽配置成质量分数为10%的溶液;

  S3在步骤S2的溶液中加入0.9mmol/L的亚硒酸盐混合均匀,调节溶液的pH为5.2,在55℃条件下搅拌60min;

  S4加入混合液体积2倍的乙醇与叔丁醇的混合液,乙醇与叔丁醇的体积比为1:4,静置24h,保留沉淀,于37℃真空干燥。

  上述步骤S1牡丹籽蛋白肽的制备,包括以下步骤:

  S11从牡丹籽粕提取牡丹蛋白;

  S12用超临界二氧化碳对得到的牡丹蛋白进行萃取;

  S13取牡丹蛋白,按照质量比为1:20加入蒸馏水溶解牡丹蛋白,调节温度在38℃,调节溶液的pH为8;

  S14溶液中加入牡丹蛋白质量的2%,比例为1:2.1的菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶,酶解时间60min;

  S15将酶解后的溶液升温到100℃,保持10min,然后再恢复到50℃;

  S16加入牡丹蛋白质量的6%,比例为1:4.2的木瓜蛋白酶和内肽酶Glu-C,酶解时间1.4h,然后迅速煮沸;S17将溶液离心分离,将上清液冻干。

  与实施例3相比,本对比例步骤S14中酶解时间更长。

  对比例7

  一种牡丹肽硒螯合物的制备方法,包括以下步骤:

  S1牡丹籽蛋白肽制备;

  S2用去离子水将牡丹籽蛋白肽配置成质量分数为10%的溶液;

  S3加入0.9mmol/L的亚硒酸盐混合均匀,调节溶液的pH为5.2,在55℃条件下搅拌60min;

  S4加入混合液体积2倍的乙醇与叔丁醇的混合液,乙醇与叔丁醇的体积比为1:4,静置24h,保留沉淀,于37℃真空干燥。

  上述步骤S1牡丹籽蛋白肽的制备,包括以下步骤:

  S11从牡丹籽粕提取牡丹蛋白;

  S12用超临界二氧化碳对得到的牡丹蛋白进行萃取;

  S13取牡丹蛋白,按照质量比为1:20加入蒸馏水溶解牡丹蛋白,调节温度在38℃,调节溶液的pH为8;

  S14加入牡丹蛋白质量的2%的菠萝蛋白酶,酶解时间40min;

  S15将步骤S14酶解后的溶液升温到100℃,保持10min,然后再恢复到50℃;

  S16加入牡丹蛋白质量的6%,比例为1:4.2的木瓜蛋白酶和内肽酶Glu-C,酶解时间1.4h,然后迅速煮沸;

  S17将溶液离心分离,将上清液冻干。

  与实施例3相比,本对比例步骤S14中只加入了菠萝蛋白酶。

  对比例8

  一种牡丹肽硒螯合物的制备方法,包括以下步骤:

  S1牡丹籽蛋白肽制备;

  S2用去离子水将牡丹籽蛋白肽配置成质量分数为10%的溶液;

  S3加入0.9mmol/L的亚硒酸盐混合均匀,调节溶液的pH为5.2,在55℃条件下搅拌60min;

  S4加入混合液体积2倍的乙醇与叔丁醇的混合液,乙醇与叔丁醇的体积比为1:4,静置24h,保留沉淀,于37℃真空干燥。

  上述步骤S1牡丹籽蛋白肽的制备,包括以下步骤:

  S11从牡丹籽粕提取牡丹蛋白;

  S12用超临界二氧化碳对得到的牡丹蛋白进行萃取;

  S13取牡丹蛋白,按照质量比为1:20加入蒸馏水溶解牡丹蛋白,调节温度在38℃,调节溶液的pH为8;

  S14加入牡丹蛋白质量的2%,比例为1:2.1的菠萝蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶,酶解时间40min;

  S15将酶解后的溶液升温到100℃,保持10min,然后再恢复到50℃;

  S16加入牡丹蛋白质量的6%的木瓜蛋白酶,酶解时间1.4h,然后迅速煮沸;

  S17将溶液离心分离,将上清液冻干。

  与实施例3相比,本对比例步骤S16中只加入了木瓜蛋白酶。

  实验例

  配制1μg/mL的硒标准溶液,精确量取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL的硒标准溶液,以去离子水加至10mL。加10mL混酸(硝酸:高氯酸=4:1)点加热炉上消解至澄清淡黄色状态。添加5mL1:1盐酸(浓盐酸:蒸馏水),电加热炉上继续消解至1mL。后加入10mL5%EDTA-2Na溶液,10mL盐酸羧胺溶液,混合后以1:1盐酸调节pH2~3之间。然后加入5‰DAB(3' 3 - 二氨基联苯胺),遮光静置30min,以40% NaOH调节溶液pH至6.8~7.0之间,以10mL 甲苯萃取反应产物10min。取有机层溶液,在420nm处检测吸光值。

  对实施例1至3,对比例1至8所得的产品重复上述步骤,计算硒的螯合率。

  螯合率(%)=(m1/m2)×100(m1为螯合物中硒元素的质量,m2为加入硒元素的质量)。

  表1 硒螯合率情况表

  从实验结果可以看出,当改变螯合的pH时对螯合蛋白肽的合同有影响。pH过高或过低螯合率都会下降。采用不同醇析,对螯合率也有影响,采用单纯的乙醇或单纯的叔丁醇的提纯效果都没有两者的混合的效果好,乙醇和叔丁醇混合产生协同作用更有利于螯合蛋白肽的析出。牡丹蛋白肽的合成对螯合率也有一定影响,牡丹肽在两步分解过程中水解程度太低,与硒螯合难度大,当水解程度过大,在醇析过程中又不易析出。

  另外,如在此使用的,在以“至少一个”开始的项的列举中使用的“或”指示分离的列举,例如“A、B或C的至少一个”的列举意味着A或B或C,或AB或AC或BC,或ABC(即A和B和C)。此外,措辞“示例的”不意味着描述的例子是优选的或者比其他例子更好。

  提供所公开的方面的以上描述以使本领域的任何技术人员能够做出或者使用本公开。对这些方面的各种修改对于本领域技术人员而言是非常显而易见的,并且在此定义的一般原理可以应用于其他方面而不脱离本公开的范围。因此,本公开不意图被限制到在此示出的方面,而是按照与在此公开的原理和新颖的特征一致的最宽范围。

  为了示例和描述的目的已经给出了以上描述。此外,此描述不意图将本公开的实施例限制到在此公开的形式。尽管以上已经讨论了多个示例方面和实施例,但是本领域技术人员将认识到其某些变型、修改、改变、添加和子组合。

  牡丹肽 2篇:

  牡丹肽饮料及其制备方法

  技术领域

  本发明属于食品领域,主要涉及一种牡丹肽饮料及其制备方法。

  背景技术

  牡丹是我国特有的木本名贵花卉,有数千年的自然生长和两千多年的人工栽培历史,素有“国色天香”、“花中之王”的美称。牡丹全身是宝,牡丹花可供观赏,还可以制成牡丹花茶、牡丹花精油;牡丹根皮是传统中药“丹皮”;牡丹籽油含有多种不饱和脂肪酸,尤其是罕见的奇数脂肪酸,是一种具有重要开发价值的食用油脂来源通过脱皮后牡丹籽仁不仅含有脂肪、蛋白质等营养成分,还含有芍药苷,白芍苷,羟基芍药苷,羟基白芍苷等芍药苷类化合物。如何全发面开发利用牡丹将会是一个非常重要且任务艰巨的研究课题。

  发明内容

  本发明的目的是提供一种牡丹肽饮料及其制备方法,该饮料蛋白含量高、营养价值高、口味佳,含有多种具有较好保健功能的活性成分,且牡丹肽分子量较小,分布均匀,最大限度的保留了牡丹籽的功能,天然、高营养、易吸收,克服了植物蛋白难以消化吸收的问题,具有显著的抗氧化、抗菌和抗肿瘤等多种生物活性。

  本发明实现上述目的采用的技术方案是:一种牡丹肽饮料,按照重量份数由以下原料制成:牡丹肽溶液30-40份、牡丹籽壳提取液1-3份、牡丹花露1-5份、牡丹花提取液1-3份、甜味剂1-3份、乳化剂0.1-0.3份和水47-64份;

  所述的牡丹肽溶液由经过炒制的牡丹籽仁加入其重量10-20倍的水磨浆后水解发酵制得;

  所述的牡丹籽壳提取液由牡丹籽壳提取出的经过干燥的提取物加入其重量6-8倍的水溶解制得;

  所述的牡丹花露为干燥牡丹花瓣经水蒸气蒸馏收集得到的馏出液;

  所述的牡丹花提取液为经过水蒸气蒸馏的牡丹花瓣提取得到的干燥提取物加入其重量6-8倍的水溶解而得。

  所述的牡丹肽饮料的制备方法,包括以下步骤:

  步骤一、牡丹肽溶液的制备

  1)取油用牡丹籽原材料,脱壳后收集牡丹籽壳,并将得到的牡丹籽仁用pH值为8.5-9.5的稀碱水浸泡除杂,再用清水洗涤3-4次,晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制5-8 min,得到炒牡丹籽仁,备用;

  2)将步骤1)得到的炒牡丹籽仁加入其重量10-20倍的水,用160-220目的研磨机中研磨2-4遍,得到牡丹籽浆液,备用;

  3)用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2)得到的牡丹籽浆液的PH值为7.5-9.6,然后加入培养成熟的混合蛋白酶,并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为0.6-1.2 %,保持温度为40-50 ℃,控制搅拌桨搅拌转数为100-200 r/min,在无菌空气下水解24-48 h,水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活,过滤除渣,即制得牡丹肽溶液,备用;

  步骤二、其他原料的制备

  取步骤一得到的牡丹籽壳加入提取液进行浸提,提取液浓缩干燥后加入其重量6-8倍的水,溶解完全,即得到牡丹籽壳提取液,备用;

  将牡丹花瓣进行水蒸气蒸馏,按照每千克干燥牡丹花瓣收集2000ml馏出液的量进行收集,得到的馏出液即为牡丹花露,备用;

  将经过水蒸气蒸馏的牡丹花瓣加水进行提取,,提取液浓缩干燥后加入其重量6-8倍的水,溶解完全,即得到牡丹花提取液,备用;

  步骤三、牡丹肽饮料的制备

  按照重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽溶液30-40份、步骤二得到的牡丹籽壳提取液1-3份、牡丹花露1-5份和牡丹花提取液1-3份,再取甜味剂1-3份、乳化剂0.1-0.3份和水47-64份,备用;先向混合釜内加入水,然后加入牡丹肽溶液,再加入乳化剂,搅拌均匀,然后依次加入牡丹籽壳提取液、牡丹花露、牡丹花提取液和甜味剂,在温度为50-60 ℃条件下搅拌20-30min,过180-200目筛,在压力为20-30Mpa下均质1-2次,最后在140-160℃温度下采用超高温瞬间杀菌15-20s,灌装,即完成牡丹肽饮料的制备。

  步骤一所述的蛋白酶混合物是指重量比为1:0.8-1.2:0.8-1.2:0-1.2:0-1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶的混合物。

  步骤二所述的牡丹籽壳提取液的具体制备方法为:取步骤一收集的牡丹籽壳,加入其重量15-25倍的水,超声提取30-50min,收集提取液并浓缩至原体积的1/4-1/5,得到浓缩液,备用;向浓缩液中加入其体积4-6倍的无水乙醇,混合后静置3-6h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/3-1/4,喷雾干燥,得到牡丹籽壳提取物,备用;向牡丹籽壳提取物中加入其重量6-8倍的水,充分溶解后过180-200目筛,得到的滤液即为牡丹籽壳提取液。

  步骤二所述的牡丹花露的具体制备方法为:取牡丹花瓣原材料,在室温下干燥至水分含量为20-30%,得到干燥牡丹花瓣,备用;然后加入干燥丹花瓣重量3-5%的食盐,揉捻后采用水蒸气蒸馏,按照每千克干燥牡丹花瓣收集2000ml馏出液的量进行收集,得到的馏出液即为牡丹花露。

  步骤二所述的牡丹花提取液的具体制备方法为:向经过蒸馏的牡丹花中加入其重量的10-15倍的水,超声提取20-30min,然后将提取液浓缩至原体积的1/4-1/5,再向浓缩液中加入体积4-6倍的无水乙醇,混合静置3-6h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/3-1/4,喷雾干燥,得到牡丹花提取物,备用;向牡丹花提取物中加入其重量6-8倍的水,充分溶解,过180-200目筛,滤液即为牡丹花提取液。

  本发明的有益效果

  其一、本发明提供的牡丹肽饮料蛋白含量高、营养价值高、口味佳,含有多种具有较好保健功能的活性成分,如芍药苷、白芍苷、羟基芍药苷、羟基白芍苷等芍药苷类化合物,具有较好的抗高血脂、抗血栓形成,扩张冠状动脉,增加冠脉流量,对抗急性心肌缺血,降低血压具有较好的疗效的,另外还能够显著提高人的增强免疫力,抗炎抗溃疡、解热解痉、利尿等。而且,充分利用复合蛋白酶来水解牡丹籽饼粕蛋白,制备得到的牡丹小肽分子量较小,分布均匀,最大限度的保留了牡丹籽的功能,天然、高营养、易吸收,克服了植物蛋白难以消化吸收的问题,具有显著的抗氧化、抗菌和抗肿瘤等多种生物活性。

  其二、本发明是以油用牡丹,主要是凤丹和紫斑牡丹牡丹籽仁为主要原料,同时充分利用牡丹籽壳、牡丹花等其它的牡丹原料资源,实现了牡丹资源的充分利用,不会造成任何牡丹资源的浪费,且本发明在制备过程对环境不产生有毒有害排放物,制备工艺简单,适合规模化生产。

  具体实施方式

  一种牡丹肽饮料,按照重量份数由以下原料制成:牡丹肽溶液30-40份、牡丹籽壳提取液1-3份、牡丹花露1-5份、牡丹花提取液1-3份、甜味剂1-3份、乳化剂0.1-0.3份和水47-64份;

  所述的牡丹肽溶液由经过炒制的牡丹籽仁加入其重量10-20倍的水磨浆后水解发酵制得;

  所述的牡丹籽壳提取液由牡丹籽壳提取出的经过干燥的提取物加入其重量6-8倍的水溶解制得;

  所述的牡丹花露为干燥牡丹花瓣经水蒸气蒸馏收集得到的馏出液;

  所述的牡丹花提取液为经过水蒸气蒸馏的牡丹花瓣提取得到的干燥提取物加入其重量6-8倍的水溶解而得。

  所述的牡丹肽饮料的制备方法,包括以下步骤:

  步骤一、牡丹肽溶液的制备

  1)取油用牡丹籽原材料,脱壳后收集牡丹籽壳,并将得到的牡丹籽仁用pH值为8.5-9.5的稀碱水浸泡除杂,再用清水洗涤3-4次,晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制5-8 min,得到炒牡丹籽仁,备用;

  2)将步骤1)得到的炒牡丹籽仁加入其重量10-20倍的水,用160-220目的研磨机中研磨2-4遍,得到牡丹籽浆液,备用;

  3)用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2)得到的牡丹籽浆液的PH值为7.5-9.6,然后加入培养成熟的混合蛋白酶,并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为0.6-1.2 %,保持温度为40-50 ℃,控制搅拌桨搅拌转数为100-200 r/min,在无菌空气下水解24-48 h,水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活,过滤除渣,即制得牡丹肽溶液,备用;

  步骤二、其他原料的制备

  取步骤一得到的牡丹籽壳加入提取液进行浸提,提取液浓缩干燥后加入其重量6-8倍的水,溶解完全,即得到牡丹籽壳提取液,备用;

  将牡丹花瓣进行水蒸气蒸馏,按照每千克干燥牡丹花瓣收集2000ml馏出液的量进行收集,得到的馏出液即为牡丹花露,备用;

  将经过水蒸气蒸馏的牡丹花瓣加水进行提取,,提取液浓缩干燥后加入其重量6-8倍的水,溶解完全,即得到牡丹花提取液,备用;

  步骤三、牡丹肽饮料的制备

  按照重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽溶液30-40份、步骤二得到的牡丹籽壳提取液1-3份、牡丹花露1-5份和牡丹花提取液1-3份,再取甜味剂1-3份、乳化剂0.1-0.3份和水47-64份,备用;先向混合釜内加入水,然后加入牡丹肽溶液,再加入乳化剂,搅拌均匀,然后依次加入牡丹籽壳提取液、牡丹花露、牡丹花提取液和甜味剂,在温度为50-60 ℃条件下搅拌20-30min,过180-200目筛,在压力为20-30Mpa下均质1-2次,最后在140-160℃温度下采用超高温瞬间杀菌15-20s,灌装,即完成牡丹肽饮料的制备。

  步骤一所述的蛋白酶混合物是指重量比为1:0.8-1.2:0.8-1.2:0-1.2:0-1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶的混合物。

  步骤二所述的牡丹籽壳提取液的具体制备方法为:取步骤一收集的牡丹籽壳,加入其重量15-25倍的水,超声提取30-50min,收集提取液并浓缩至原体积的1/4-1/5,得到浓缩液,备用;向浓缩液中加入其体积4-6倍的无水乙醇,混合后静置3-6h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/3-1/4,喷雾干燥,得到牡丹籽壳提取物,备用;向牡丹籽壳提取物中加入其重量6-8倍的水,充分溶解后过180-200目筛,得到的滤液即为牡丹籽壳提取液。

  步骤二所述的牡丹花露的具体制备方法为:取牡丹花瓣原材料,在室温下干燥至水分含量为20-30%,得到干燥牡丹花瓣,备用;然后加入干燥丹花瓣重量3-5%的食盐,揉捻后采用水蒸气蒸馏,按照每千克干燥牡丹花瓣收集2000ml馏出液的量进行收集,得到的馏出液即为牡丹花露。

  步骤二所述的牡丹花提取液的具体制备方法为:向经过蒸馏的牡丹花中加入其重量的10-15倍的水,超声提取20-30min,然后将提取液浓缩至原体积的1/4-1/5,再向浓缩液中加入体积4-6倍的无水乙醇,混合静置3-6h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/3-1/4,喷雾干燥,得到牡丹花提取物,备用;向牡丹花提取物中加入其重量6-8倍的水,充分溶解,过180-200目筛,滤液即为牡丹花提取液。

  本发明中所述的牡丹籽为油用牡丹籽,主要有凤丹牡丹和紫斑牡丹等。在制备牡丹肽过程中,采用的过滤方法是板框过滤或者膜过滤,水解得到的牡丹肽分子量在200-5000道尔顿之间,且该牡丹肽具有抗氧化、抗肿瘤及抗菌等多种活性。

  以下结合具体实施例对本发明做进一步说明:

  实施例1:

  一种牡丹肽饮料,按照重量份数由以下原料制成:牡丹肽溶液40份、牡丹籽壳提取液3份、牡丹花露5份、牡丹花提取液1份、甜味剂3份、乳化剂0.3份和水47份;

  所述的牡丹肽饮料的制备方法,包括以下步骤:

  步骤一、牡丹肽溶液的制备

  1)取凤丹牡丹籽原材料,脱壳后收集牡丹籽壳,并将得到的牡丹籽仁用pH值为9.5的稀碱水浸泡除杂,再用清水洗涤4次,晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制5 min,得到炒牡丹籽仁,备用;

  2)将步骤1)得到的炒牡丹籽仁加入其重量20倍的水,用220目的研磨机中研磨4遍,得到牡丹籽浆液,备用;

  3)用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2)得到的牡丹籽浆液的PH值为9.6,然后加入培养成熟的混合蛋白酶,并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为1.2 %,所述的蛋白酶混合物是指重量比为1:1.2:1.2:1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和碱性2709蛋白酶的混合物,保持温度为50 ℃,控制搅拌桨搅拌转数为200 r/min,在无菌空气下水解48 h,水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活,过滤除渣,即制得牡丹肽溶液,备用;

  步骤二、其他原料的制备

  取步骤一收集的牡丹籽壳,加入其重量25倍的水,超声提取50min,收集提取液并浓缩至原体积的1/5,得到浓缩液,备用;向浓缩液中加入其体积6倍的无水乙醇,混合后静置6h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/4,喷雾干燥,得到牡丹籽壳提取物,备用;向牡丹籽壳提取物中加入其重量8倍的水,充分溶解后过200目筛,得到的滤液即为牡丹籽壳提取液,备用;

  取牡丹花瓣原材料,在室温下干燥至水分含量为30%,得到干燥牡丹花瓣,备用;然后加入干燥丹花瓣重量5%的食盐,揉捻后采用水蒸气蒸馏,按照每千克干燥牡丹花瓣收集2000ml馏出液的量进行收集,得到的馏出液即为牡丹花露,备用;

  向经过蒸馏的牡丹花中加入其重量的15倍的水,超声提取30min,然后将提取液浓缩至原体积的1/5,再向浓缩液中加入体积6倍的无水乙醇,混合静置6h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/4,喷雾干燥,得到牡丹花提取物,备用;向牡丹花提取物中加入其重量8倍的水,充分溶解,过200目筛,滤液即为牡丹花提取液,备用;

  步骤三、牡丹肽饮料的制备

  按照上述重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽溶液、步骤二得到的牡丹籽壳提取液、牡丹花露和牡丹花提取液,再取甜味剂、乳化剂和水,备用;先向混合釜内加入水,然后加入牡丹肽溶液,再加入乳化剂,搅拌均匀,然后依次加入牡丹籽壳提取液、牡丹花露、牡丹花提取液和甜味剂,在温度为60 ℃条件下搅拌30min,过200目筛,在压力为30Mpa下均质2次,最后在160℃温度下采用超高温瞬间杀菌20s,灌装,即完成牡丹肽饮料的制备。

  实施例2:

  一种牡丹肽饮料,按照重量份数由以下原料制成:牡丹肽溶液30份、牡丹籽壳提取液1份、牡丹花露1份、牡丹花提取液3份、甜味剂1份、乳化剂0.1份和水64份;

  所述的牡丹肽饮料的制备方法,包括以下步骤:

  步骤一、牡丹肽溶液的制备

  1)取紫斑牡丹籽原材料,脱壳后收集牡丹籽壳,并将得到的牡丹籽仁用pH值为8.5的稀碱水浸泡除杂,再用清水洗涤3次,晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制5 min,得到炒牡丹籽仁,备用;

  2)将步骤1)得到的炒牡丹籽仁加入其重量10倍的水,用160目的研磨机中研磨2遍,得到牡丹籽浆液,备用;

  3)用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2)得到的牡丹籽浆液的PH值为7.5,然后加入培养成熟的混合蛋白酶,并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为0.6 %,所述的蛋白酶混合物是指重量比为1:0.8:0.8:1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶的混合物,保持温度为40 ℃,控制搅拌桨搅拌转数为100 r/min,在无菌空气下水解24 h,水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活,过滤除渣,即制得牡丹肽溶液,备用;

  步骤二、其他原料的制备

  取步骤一收集的牡丹籽壳,加入其重量15倍的水,超声提取30min,收集提取液并浓缩至原体积的1/4,得到浓缩液,备用;向浓缩液中加入其体积4倍的无水乙醇,混合后静置3h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/3,喷雾干燥,得到牡丹籽壳提取物,备用;向牡丹籽壳提取物中加入其重量6倍的水,充分溶解后过180目筛,得到的滤液即为牡丹籽壳提取液,备用;

  取牡丹花瓣原材料,在室温下干燥至水分含量为20%,得到干燥牡丹花瓣,备用;然后加入干燥丹花瓣重量3%的食盐,揉捻后采用水蒸气蒸馏,按照每千克干燥牡丹花瓣收集2000ml馏出液的量进行收集,得到的馏出液即为牡丹花露,备用;

  向经过蒸馏的牡丹花中加入其重量的10倍的水,超声提取20min,然后将提取液浓缩至原体积的1/4,再向浓缩液中加入体积4倍的无水乙醇,混合静置3h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/3,喷雾干燥,得到牡丹花提取物,备用;向牡丹花提取物中加入其重量6倍的水,充分溶解,过180目筛,滤液即为牡丹花提取液,备用;

  步骤三、牡丹肽饮料的制备

  按照上述重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽溶液、步骤二得到的牡丹籽壳提取液、牡丹花露和牡丹花提取液,再取甜味剂、乳化剂和水,备用;先向混合釜内加入水,然后加入牡丹肽溶液,再加入乳化剂,搅拌均匀,然后依次加入牡丹籽壳提取液、牡丹花露、牡丹花提取液和甜味剂,在温度为50 ℃条件下搅拌20min,过180目筛,在压力为20Mpa下均质1次,最后在140℃温度下采用超高温瞬间杀菌15s,灌装,即完成牡丹肽饮料的制备。

  实施例3:

  一种牡丹肽饮料,按照重量份数由以下原料制成:牡丹肽溶液35份、牡丹籽壳提取液2份、牡丹花露3份、牡丹花提取液2份、甜味剂2份、乳化剂0.2份和水56份;

  所述的牡丹肽饮料的制备方法,包括以下步骤:

  步骤一、牡丹肽溶液的制备

  1)取油用牡丹籽原材料,脱壳后收集牡丹籽壳,并将得到的牡丹籽仁用pH值为9.0的稀碱水浸泡除杂,再用清水洗涤3次,晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制8 min,得到炒牡丹籽仁,备用;

  2)将步骤1)得到的炒牡丹籽仁加入其重量20倍的水,用220目的研磨机中研磨2遍,得到牡丹籽浆液,备用;

  3)用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2)得到的牡丹籽浆液的PH值为8.5,然后加入培养成熟的混合蛋白酶,并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为0.9 %,所述的蛋白酶混合物是指重量比为1:1.0:1.0:0.8的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和碱性2709蛋白酶的混合物,保持温度为40-50 ℃,控制搅拌桨搅拌转数为150 r/min,在无菌空气下水解36h,水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活,过滤除渣,即制得牡丹肽溶液,备用;

  步骤二、其他原料的制备

  取步骤一收集的牡丹籽壳,加入其重量20倍的水,超声提取40min,收集提取液并浓缩至原体积的1/5,得到浓缩液,备用;向浓缩液中加入其体积5倍的无水乙醇,混合后静置5h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/3,喷雾干燥,得到牡丹籽壳提取物,备用;向牡丹籽壳提取物中加入其重量6倍的水,充分溶解后过200目筛,得到的滤液即为牡丹籽壳提取液,备用;

  取牡丹花瓣原材料,在室温下干燥至水分含量为30%,得到干燥牡丹花瓣,备用;然后加入干燥丹花瓣重量3%的食盐,揉捻后采用水蒸气蒸馏,按照每千克干燥牡丹花瓣收集2000ml馏出液的量进行收集,得到的馏出液即为牡丹花露,备用;

  向经过蒸馏的牡丹花中加入其重量的10倍的水,超声提取30min,然后将提取液浓缩至原体积的1/4,再向浓缩液中加入体积4倍的无水乙醇,混合静置6h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/3,喷雾干燥,得到牡丹花提取物,备用;向牡丹花提取物中加入其重量6倍的水,充分溶解,过200目筛,滤液即为牡丹花提取液,备用;

  步骤三、牡丹肽饮料的制备

  按照上述重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽溶液、步骤二得到的牡丹籽壳提取液、牡丹花露和牡丹花提取液,再取甜味剂、乳化剂和水,备用;先向混合釜内加入水,然后加入牡丹肽溶液,再加入乳化剂,搅拌均匀,然后依次加入牡丹籽壳提取液、牡丹花露、牡丹花提取液和甜味剂,在温度为55 ℃条件下搅拌25min,过190目筛,在压力为25Mpa下均质2次,最后在150℃温度下采用超高温瞬间杀菌20s,灌装,即完成牡丹肽饮料的制备。

  实施例4:

  一种牡丹肽饮料,按照重量份数由以下原料制成:牡丹肽溶液36份、牡丹籽壳提取液2份、牡丹花露3份、牡丹花提取液2份、甜味剂1份、乳化剂0.2份和水56份;

  所述的牡丹肽饮料的制备方法,包括以下步骤:

  步骤一、牡丹肽溶液的制备

  1)取凤丹牡丹籽原材料,脱壳后收集牡丹籽壳,并将得到的牡丹籽仁用pH值为9.5的稀碱水浸泡除杂,再用清水洗涤4次,晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制5 min,得到炒牡丹籽仁,备用;

  2)将步骤1)得到的炒牡丹籽仁加入其重量18倍的水,用220目的研磨机中研磨4遍,得到牡丹籽浆液,备用;

  3)用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2)得到的牡丹籽浆液的PH值为9.6,然后加入培养成熟的混合蛋白酶,并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为1.2 %,所述的蛋白酶混合物是指重量比为1:1.2:0.8:1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和碱性2709蛋白酶的混合物,保持温度为50 ℃,控制搅拌桨搅拌转数为200 r/min,在无菌空气下水解48 h,水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活,过滤除渣,即制得牡丹肽溶液,备用;

  步骤二、其他原料的制备

  取步骤一收集的牡丹籽壳,加入其重量25倍的水,超声提取50min,收集提取液并浓缩至原体积的1/5,得到浓缩液,备用;向浓缩液中加入其体积6倍的无水乙醇,混合后静置6h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/4,喷雾干燥,得到牡丹籽壳提取物,备用;向牡丹籽壳提取物中加入其重量8倍的水,充分溶解后过200目筛,得到的滤液即为牡丹籽壳提取液,备用;

  取牡丹花瓣原材料,在室温下干燥至水分含量为30%,得到干燥牡丹花瓣,备用;然后加入干燥丹花瓣重量5%的食盐,揉捻后采用水蒸气蒸馏,按照每千克干燥牡丹花瓣收集2000ml馏出液的量进行收集,得到的馏出液即为牡丹花露,备用;

  向经过蒸馏的牡丹花中加入其重量的15倍的水,超声提取30min,然后将提取液浓缩至原体积的1/5,再向浓缩液中加入体积6倍的无水乙醇,混合静置6h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/4,喷雾干燥,得到牡丹花提取物,备用;向牡丹花提取物中加入其重量8倍的水,充分溶解,过200目筛,滤液即为牡丹花提取液,备用;

  步骤三、牡丹肽饮料的制备

  按照上述重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽溶液、步骤二得到的牡丹籽壳提取液、牡丹花露和牡丹花提取液,再取甜味剂、乳化剂和水,备用;先向混合釜内加入水,然后加入牡丹肽溶液,再加入乳化剂,搅拌均匀,然后依次加入牡丹籽壳提取液、牡丹花露、牡丹花提取液和甜味剂,在温度为60 ℃条件下搅拌30min,过200目筛,在压力为30Mpa下均质2次,最后在160℃温度下采用超高温瞬间杀菌20s,灌装,即完成牡丹肽饮料的制备。

  活性测试试验

  1. 抗肿瘤活性研究

  1) 试验材料

  胎牛血清,96孔培养板,恒温箱,RPM1640培养液。

  2) 方法

  对上述实施例中得到的牡丹肽进行细胞毒活性测试,采用的方法为MTT法。

  3) 试验步骤

  (1) 取对数生长期细胞,用含10%胎牛血清的RPM1640培养液,制成单细胞悬液5×104个/mL,将该悬液加到96孔培养板中,每孔加入1×104个细胞。培养24 h后,加入受试牡丹肽浓度分别为30 μg/mL、10 μg/mL。

  (2) 将平板在37 ℃,含5%CO2空气及100%湿度的恒温箱中孵育3天,去除培养液。

  (3) MTT用无血清的RPM1640培养液配成1 mg/mL溶液,每孔加100 μL,37℃温育4 h,使MTT还原为甲臢。

  (4) 吸出上层清液,加入150 μL DMSO使甲臢溶解,于ELISA仪570 nm处测OD值。

  4) 试验结果

  表1 牡丹肽细胞毒活性实验数据(n=3)

  2. 抗氧化活性研究

  1) 试验材料

  牡丹肽粉末(制备方法见实施例1)。

  亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、吩嗪甲酯硫酸盐(PMS)、氯化硝基四氮唑(NBT)、无水乙醇、双氧水、2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、盐酸(HC1)均为分析纯,大豆卵磷脂(>90%)。

  2) 方法

  (1) 清除超氧阴离子自由基(O-2·)的测定方法

  用pH8.0、浓度50mol/L的Tris-HCl缓冲液将牡丹肽稀释成不同的浓度梯度,各取1.5mL不同浓度牡丹肽溶液,然后依次加入0.5mL NBT (300μmol/L,以pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制),0.5mL NADH (468 μmol/L,以pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制),0.5mL PMS (60μmol/L,以pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制),混匀后在25℃中水浴5分钟,取出在波长560 nm处测定吸光度,空白对照组以缓冲液代替芪类溶液。

  E(O-2·)(%)=(1-)×100 (1)

  式中:E(O-2·)为牡丹小肽对O-2·的清除率(%);A1为芪类吸光度;A0为空白吸光度。

  (2) 清除DPPH 自由基的测定方法

  将牡丹肽稀释成不同的浓度梯度,各取2 mL上述浓度的溶液于试管中,再加入2 mL浓度为0.04mg/mL的DPPH溶液,混合均匀,反应20分钟,3500 r/min离心分离10分钟,取上清液在波长517 nm处测其吸光度为Ai;另各取2mL上述浓度的牡丹肽溶液于试管中,分别加入无水乙醇2 mL,反应20分钟,3500 r/min离心分离10分钟,取上清液在波长517nm处测其吸光度为Aj;以2 mL 0.04 mg/mL DPPH 和2 mL无水乙醇反应作为参比,其吸光度记为A0。

  E(DPPH)(%)=(1-)×100 (2)

  式中:E(DPPH)为牡丹肽对DPPH自由基的清除率(%);A0为2mL DPPH溶液+2mL 无水乙醇的吸光度;Ai为2mL DPPH溶液+2mL牡丹肽溶液的吸光度;Aj为2mL无水乙醇+2mL牡丹肽的吸光度。

  (3) 清除羟自由基(·OH)的测定方法

  将牡丹肽用双蒸水配制成不同浓度梯度,各取2mL上述浓度的溶液,依次加入2mL 6 mmol/L的FeSO4、2 mL 6 mmol/L的H2O2,混匀后静置10分钟,再加入2mL 6 mmol/L水杨酸,混匀,静置30分钟,在波长510 nm处测其吸光度记为Ai,当用双蒸水代替水杨酸时的吸光度记为Aj。空白对照组以双蒸水代替牡丹肽溶液吸光度记为A0。

  E(·OH)(%)= (1-)×100

  式中:E(·OH)为羟自由基的清除率(%);Ai为牡丹肽反应的吸光度;A0为空白吸光度;Aj为无水杨酸参加反应时芪类的吸光度。

  3) 结果

  (1) 清除超氧阴离子自由基(O2-·)

  表2 牡丹肽清除超氧阴离子自由基(O2-·)活性(%)

  由表2可知,在所选质量浓度范围内,牡丹肽化合物具有清除超氧阴离子自由基的能力。随着质量浓度的增大,对超氧阴离子自由基的清除作用增强,呈现量效关系,总体效果比BHT一致。

  (2) 清除DPPH 自由基

  表3牡丹肽清除DPPH 自由基活性

  DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基,对其清除的效果表明受试药物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。由表3可知,牡丹肽化合物表现出很强的清除DPPH自由基的能力。

  (3) 清除羟自由基(·OH)

  表4 牡丹肽清除羟自由基(·OH)活性

  羟基自由基是最强的氧化剂,在生物体内几乎可以和所有细胞成分发生反应,对机体危害很大。由表4可知,牡丹肽清除·OH效果和BHT相比稍弱一些。

  牡丹肽 3篇:

  一种牡丹肽软胶囊及其制备方法

  技术领域

  本发明属于保健品领域,主要涉及一种牡丹肽软胶囊及其制备方法。

  背景技术

  牡丹是我国特有的木本名贵花卉,有数千年的自然生长和两千多年的人工栽培历史,素有“国色天香”、“花中之王”的美称。牡丹全身是宝,牡丹花可供观赏,还可以制成牡丹花茶、牡丹花精油;牡丹根皮是传统中药“丹皮”;牡丹籽油含有多种不饱和脂肪酸,尤其是罕见的奇数脂肪酸,是一种具有重要开发价值的食用油脂来源通过脱皮后牡丹籽仁不仅含有脂肪、蛋白质等营养成分,还含有芍药苷,白芍苷,羟基芍药苷,羟基白芍苷等芍药苷类化合物。如何全发面开发利用牡丹将会是一个非常重要且任务艰巨的研究课题。

  发明内容

  本发明的目的是提供一种牡丹肽软胶囊及其制备方法,该软胶囊营养价值高,含有多种具有较好保健功能的活性成分,且牡丹肽分子量较小,分布均匀,最大限度的保留了牡丹籽的功能,天然、高营养、易吸收,具有显著的抗氧化、抗菌和抗肿瘤等多种生物活性。

  本发明实现上述目的采用的技术方案是:一种牡丹肽软胶囊,所述的软胶囊的填充物按照重量份数由以下原料制成:牡丹肽粉30-40份、牡丹籽壳提取物1-3份、牡丹花提取物1-3份、蜂蜡3-8份和牡丹籽油48-63份;

  所述的牡丹肽粉为牡丹籽仁经蛋白酶水解后干燥得到的粉末;

  所述的牡丹籽壳提取物为从牡丹籽壳中提取,并干燥的提取物;

  所述的牡丹花提取物为从经过水蒸气蒸馏的牡丹花花瓣中提取,并干燥的提取物。

  所述的牡丹肽软胶囊的制备方法,包括以下步骤:

  步骤一、牡丹肽的制备

  1)取油用牡丹籽原材料,脱壳后收集牡丹籽壳,并将得到的牡丹籽仁用pH值为8.5-9.5的稀碱水浸泡除杂,再用清水洗涤3-4次,晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制5-8 min,得到牡丹籽仁,备用;

  2)将步骤1)得到的牡丹籽仁加入其重量10-20倍的水,用160-220目的研磨机研磨2-4遍,得到牡丹籽浆液,备用;

  3)用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2)得到的牡丹籽浆液的PH值为7.5-9.6,然后加入培养成熟的混合蛋白酶,并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为0.6-1.2 %,保持温度为40-50 ℃,控制搅拌桨搅拌转数为100-200 r/min,在无菌空气下水解24-48 h,水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活,过滤除渣,经喷雾干燥后即制得牡丹肽粉,备用;

  步骤二、牡丹籽壳提取物的制备

  取步骤一收集的牡丹籽壳,加入其重量15-25倍的水,超声提取30-50min,收集提取液并浓缩至原体积的1/4-1/5,得到浓缩液,备用;向浓缩液中加入其体积4-6倍的无水乙醇,混合后静置3-6h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/3-1/4,喷雾干燥,即得到牡丹籽壳提取物,备用;

  步骤三、牡丹花提取物的制备

  取水分含量为20-30%的牡丹花瓣原材料,加入其重量3-5%的食盐,揉捻后采用水蒸气蒸馏,向蒸馏结束后的牡丹花中加入其重量的10-15倍的水,超声提取20-30min,然后将提取液浓缩至原体积的1/4-1/5,再向浓缩液中加入体积4-6倍的无水乙醇,混合静置3-6h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/3-1/4,喷雾干燥,即得到牡丹花提取物,备用;

  步骤四、牡丹肽软胶囊的制备

  按照重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽粉30-40份、步骤二得到的牡丹籽壳提取物1-3份和步骤三得到的牡丹花提取物1-3份,再取蜂蜡3-8份和牡丹籽油48-63份,备用;先向混合釜内加入牡丹籽油,然后边搅拌边加入牡丹肽粉,牡丹肽粉加入完成后再加入蜂蜡,搅拌均匀后依次加入牡丹籽壳提取物和牡丹花提取物,并在温度为65-75 ℃条件下搅拌20-30min,然后用180-220目研磨机研磨2-4次,在压力为20-30Mpa下均质1-2次,在140-160℃温度下采用超高温瞬间杀菌15-20秒,得到混合底料,备用;将混合底料采用常规方法填充在由明胶、甘油和水制备的软胶囊中,即完成牡丹肽软胶囊的制备。

  步骤一所述的混合蛋白酶是指重量比为1:0.8-1.2:0.8-1.2:0-1.2:0-1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶的混合物。

  本发明的有益效果

  其一、本发明提供的牡丹肽软胶囊营养价值高,具有显著的抗氧化、抗菌和抗肿瘤等多种生物活性,同时含有多种具有较好保健功能的活性成分,如芍药苷、白芍苷、羟基芍药苷、羟基白芍苷等芍药苷类化合物,具有较好的抗高血脂、抗血栓形成,扩张冠状动脉,增加冠脉流量,对抗急性心肌缺血,降低血压具有较好的疗效,另外还能够显著提高人的免疫力,抗炎抗溃疡、解热解痉、利尿等。而且,充分利用复合蛋白酶来水解牡丹籽饼粕蛋白,制备得到的牡丹小肽分子量较小,分布均匀,最大限度的保留了牡丹籽的功能,天然、高营养、易吸收。

  其二、本发明是以油用牡丹,主要是凤丹和紫斑牡丹牡丹籽仁为主要原料,同时充分利用牡丹籽壳、牡丹花等其它的牡丹原料资源,实现了牡丹资源的充分利用,不会造成任何牡丹资源的浪费,且本发明在制备过程对环境不产生有毒有害排放物,制备工艺简单,适合规模化生产。

  具体实施方式

  一种牡丹肽软胶囊,所述的软胶囊的填充物按照重量份数由以下原料制成:牡丹肽粉30-40份、牡丹籽壳提取物1-3份、牡丹花提取物1-3份、蜂蜡3-8份和牡丹籽油48-63份;

  所述的牡丹肽粉为牡丹籽仁经蛋白酶水解后干燥得到的粉末;

  所述的牡丹籽壳提取物为从牡丹籽壳中提取,并干燥的提取物;

  所述的牡丹花提取物为从经过水蒸气蒸馏的牡丹花花瓣中提取,并干燥的提取物。

  所述的牡丹肽软胶囊的制备方法,包括以下步骤:

  步骤一、牡丹肽的制备

  1)取油用牡丹籽原材料,脱壳后收集牡丹籽壳,并将得到的牡丹籽仁用pH值为8.5-9.5的稀碱水浸泡除杂,再用清水洗涤3-4次,晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制5-8 min,得到牡丹籽仁,备用;

  2)将步骤1)得到的牡丹籽仁加入其重量10-20倍的水,用160-220目的研磨机研磨2-4遍,得到牡丹籽浆液,备用;

  3)用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2)得到的牡丹籽浆液的PH值为7.5-9.6,然后加入培养成熟的混合蛋白酶,并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为0.6-1.2 %,保持温度为40-50 ℃,控制搅拌桨搅拌转数为100-200 r/min,在无菌空气下水解24-48 h,水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活,过滤除渣,经喷雾干燥后即制得牡丹肽粉,备用;

  步骤二、牡丹籽壳提取物的制备

  取步骤一收集的牡丹籽壳,加入其重量15-25倍的水,超声提取30-50min,收集提取液并浓缩至原体积的1/4-1/5,得到浓缩液,备用;向浓缩液中加入其体积4-6倍的无水乙醇,混合后静置3-6h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/3-1/4,喷雾干燥,即得到牡丹籽壳提取物,备用;

  步骤三、牡丹花提取物的制备

  取水分含量为20-30%的牡丹花瓣原材料,加入其重量3-5%的食盐,揉捻后采用水蒸气蒸馏,向蒸馏结束后的牡丹花中加入其重量的10-15倍的水,超声提取20-30min,然后将提取液浓缩至原体积的1/4-1/5,再向浓缩液中加入体积4-6倍的无水乙醇,混合静置3-6h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/3-1/4,喷雾干燥,即得到牡丹花提取物,备用;

  步骤四、牡丹肽软胶囊的制备

  按照重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽粉30-40份、步骤二得到的牡丹籽壳提取物1-3份和步骤三得到的牡丹花提取物1-3份,再取蜂蜡3-8份和牡丹籽油48-63份,备用;先向混合釜内加入牡丹籽油,然后边搅拌边加入牡丹肽粉,牡丹肽粉加入完成后再加入蜂蜡,搅拌均匀后依次加入牡丹籽壳提取物和牡丹花提取物,并在温度为65-75 ℃条件下搅拌20-30min,然后用180-220目研磨机研磨2-4次,在压力为20-30Mpa下均质1-2次,在140-160℃温度下采用超高温瞬间杀菌15-20秒,得到混合底料,备用;将混合底料采用常规方法填充在由明胶、甘油和水制备的软胶囊中,即完成牡丹肽软胶囊的制备。

  步骤一所述的混合蛋白酶是指重量比为1:0.8-1.2:0.8-1.2:0-1.2:0-1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶的混合物。

  本发明中所述的牡丹籽为油用牡丹籽,主要有凤丹牡丹和紫斑牡丹等。在制备牡丹肽过程中,采用的过滤方法是板框过滤或者膜过滤,水解得到的牡丹肽分子量在200-5000道尔顿之间,且该牡丹肽具有抗氧化、抗肿瘤及抗菌等多种活性。

  以下结合具体实施例对本发明做进一步说明:

  实施例1:

  一种牡丹肽软胶囊,所述的软胶囊的填充物按照重量份数由以下原料制成:牡丹肽粉40份、牡丹籽壳提取物3份、牡丹花提取物1份、蜂蜡8份和牡丹籽油48份;

  所述的牡丹肽软胶囊的制备方法,包括以下步骤:

  步骤一、牡丹肽的制备

  1)取凤丹牡丹籽原材料,脱壳后收集牡丹籽壳,并将得到的牡丹籽仁用pH值为9.5的稀碱水浸泡除杂,再用清水洗涤4次,晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制8 min,得到牡丹籽仁,备用;

  2)将步骤1)得到的牡丹籽仁加入其重量20倍的水,用160-220目的研磨机研磨4遍,得到牡丹籽浆液,备用;

  3)用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2)得到的牡丹籽浆液的PH值为9.6,然后加入培养成熟的混合蛋白酶,并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为1.2%,所述的混合蛋白酶是指重量比为1:1.2:1.2:1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和碱性2709蛋白酶的混合物,保持温度为50 ℃,控制搅拌桨搅拌转数为200 r/min,在无菌空气下水解48 h,水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活,过滤除渣,经喷雾干燥后即制得牡丹肽粉,备用;

  步骤二、牡丹籽壳提取物的制备

  取步骤一收集的牡丹籽壳,加入其重量25倍的水,超声提取50min,收集提取液并浓缩至原体积的1/5,得到浓缩液,备用;向浓缩液中加入其体积6倍的无水乙醇,混合后静置6h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/4,喷雾干燥,即得到牡丹籽壳提取物,备用;

  步骤三、牡丹花提取物的制备

  取水分含量为20-30%的牡丹花瓣原材料,加入其重量5%的食盐,揉捻后采用水蒸气蒸馏,向蒸馏结束后的牡丹花中加入其重量的15倍的水,超声提取30min,然后将提取液浓缩至原体积的1/5,再向浓缩液中加入体积6倍的无水乙醇,混合静置6h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/4,喷雾干燥,即得到牡丹花提取物,备用;

  步骤四、牡丹肽软胶囊的制备

  按照上述重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽粉、步骤二得到的牡丹籽壳提取物和步骤三得到的牡丹花提取物,再取蜂蜡和牡丹籽油,备用;先向混合釜内加入牡丹籽油,然后边搅拌边加入牡丹肽粉,牡丹肽粉加入完成后再加入蜂蜡,搅拌均匀后依次加入牡丹籽壳提取物和牡丹花提取物,并在温度为75 ℃条件下搅拌30min,然后用220目研磨机研磨4次,在压力为20-30Mpa下均质2次,在140-160℃温度下采用超高温瞬间杀菌20秒,得到混合底料,备用;将混合底料采用常规方法填充在由明胶、甘油和水制备的软胶囊中,即完成牡丹肽软胶囊的制备。

  实施例2:

  一种牡丹肽软胶囊,所述的软胶囊的填充物按照重量份数由以下原料制成:牡丹肽粉30份、牡丹籽壳提取物1份、牡丹花提取物3份、蜂蜡3份和牡丹籽油63份;

  所述的牡丹肽软胶囊的制备方法,包括以下步骤:

  步骤一、牡丹肽的制备

  1)取紫斑牡丹籽原材料,脱壳后收集牡丹籽壳,并将得到的牡丹籽仁用pH值为8.5的稀碱水浸泡除杂,再用清水洗涤3次,晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制5 min,得到牡丹籽仁,备用;

  2)将步骤1)得到的牡丹籽仁加入其重量10倍的水,用160-220目的研磨机研磨2遍,得到牡丹籽浆液,备用;

  3)用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2)得到的牡丹籽浆液的PH值为7.5,然后加入培养成熟的混合蛋白酶,并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为0.6 %,所述的蛋白酶混合物是指重量比为1:0.8:0.8:1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶的混合物,保持温度为40 ℃,控制搅拌桨搅拌转数为100r/min,在无菌空气下水解24 h,水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活,过滤除渣,经喷雾干燥后即制得牡丹肽粉,备用;

  步骤二、牡丹籽壳提取物的制备

  取步骤一收集的牡丹籽壳,加入其重量15倍的水,超声提取30min,收集提取液并浓缩至原体积的1/4,得到浓缩液,备用;向浓缩液中加入其体积4倍的无水乙醇,混合后静置3h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/3,喷雾干燥,即得到牡丹籽壳提取物,备用;

  步骤三、牡丹花提取物的制备

  取水分含量为20-30%的牡丹花瓣原材料,加入其重量3%的食盐,揉捻后采用水蒸气蒸馏,向蒸馏结束后的牡丹花中加入其重量的10倍的水,超声提取20min,然后将提取液浓缩至原体积的1/4,再向浓缩液中加入体积4倍的无水乙醇,混合静置3h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/3,喷雾干燥,即得到牡丹花提取物,备用;

  步骤四、牡丹肽软胶囊的制备

  按照上述重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽粉、步骤二得到的牡丹籽壳提取物和步骤三得到的牡丹花提取物,再取蜂蜡和牡丹籽油,备用;先向混合釜内加入牡丹籽油,然后边搅拌边加入牡丹肽粉,牡丹肽粉加入完成后再加入蜂蜡,搅拌均匀后依次加入牡丹籽壳提取物和牡丹花提取物,并在温度为65℃条件下搅拌20min,然后用180目研磨机研磨2次,在压力为20-30Mpa下均质1次,在140-160℃温度下采用超高温瞬间杀菌15秒,得到混合底料,备用;将混合底料采用常规方法填充在由明胶、甘油和水制备的软胶囊中,即完成牡丹肽软胶囊的制备。

  实施例3:

  一种牡丹肽软胶囊,所述的软胶囊的填充物按照重量份数由以下原料制成:牡丹肽粉35份、牡丹籽壳提取物2份、牡丹花提取物2份、蜂蜡5份和牡丹籽油56份;

  所述的牡丹肽软胶囊的制备方法,包括以下步骤:

  步骤一、牡丹肽的制备

  1)取凤丹牡丹籽原材料,脱壳后收集牡丹籽壳,并将得到的牡丹籽仁用pH值为9.0的稀碱水浸泡除杂,再用清水洗涤3次,晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制7min,得到牡丹籽仁,备用;

  2)将步骤1)得到的牡丹籽仁加入其重量15倍的水,用190目的研磨机研磨3遍,得到牡丹籽浆液,备用;

  3)用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2)得到的牡丹籽浆液的PH值为8.6,然后加入培养成熟的混合蛋白酶,并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为0.9 %,所述的蛋白酶混合物是指重量比为1:0.8:1.0:0.6:0.6的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶的混合物,保持温度为45 ℃,控制搅拌桨搅拌转数为150 r/min,在无菌空气下水解36 h,水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活,过滤除渣,经喷雾干燥后即制得牡丹肽粉,备用;

  步骤二、牡丹籽壳提取物的制备

  取步骤一收集的牡丹籽壳,加入其重量20倍的水,超声提取40min,收集提取液并浓缩至原体积的1/5,得到浓缩液,备用;向浓缩液中加入其体积5倍的无水乙醇,混合后静置5h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/4,喷雾干燥,即得到牡丹籽壳提取物,备用;

  步骤三、牡丹花提取物的制备

  取水分含量为20-30%的牡丹花瓣原材料,加入其重量4%的食盐,揉捻后采用水蒸气蒸馏,向蒸馏结束后的牡丹花中加入其重量的13倍的水,超声提取25min,然后将提取液浓缩至原体积的1/4,再向浓缩液中加入体积5倍的无水乙醇,混合静置5h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/4,喷雾干燥,即得到牡丹花提取物,备用;

  步骤四、牡丹肽软胶囊的制备

  按照上述重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽粉、步骤二得到的牡丹籽壳提取物和步骤三得到的牡丹花提取物,再取蜂蜡和牡丹籽油,备用;先向混合釜内加入牡丹籽油,然后边搅拌边加入牡丹肽粉,牡丹肽粉加入完成后再加入蜂蜡,搅拌均匀后依次加入牡丹籽壳提取物和牡丹花提取物,并在温度为70 ℃条件下搅拌25min,然后用200目研磨机研磨3次,在压力为20-30Mpa下均质2次,在140-160℃温度下采用超高温瞬间杀菌18秒,得到混合底料,备用;将混合底料采用常规方法填充在由明胶、甘油和水制备的软胶囊中,即完成牡丹肽软胶囊的制备。

  实施例4:

  一种牡丹肽软胶囊,所述的软胶囊的填充物按照重量份数由以下原料制成:牡丹肽粉35份、牡丹籽壳提取物2份、牡丹花提取物2份、蜂蜡4份和牡丹籽油63份;

  所述的牡丹肽软胶囊的制备方法,包括以下步骤:

  步骤一、牡丹肽的制备

  1)取油用牡丹籽原材料,脱壳后收集牡丹籽壳,并将得到的牡丹籽仁用pH值为8.5的稀碱水浸泡除杂,再用清水洗涤3次,晾干水分后在150-180℃的炒锅中炒制5 min,得到牡丹籽仁,备用;

  2)将步骤1)得到的牡丹籽仁加入其重量10倍的水,用160-220目的研磨机研磨4遍,得到牡丹籽浆液,备用;

  3)用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节步骤2)得到的牡丹籽浆液的PH值为7.5,然后加入培养成熟的混合蛋白酶,并使牡丹籽浆液中蛋白酶的质量百分数为0.8 %,所述的蛋白酶混合物是指重量比为1:1.0:0.8:1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和碱性2709蛋白酶的混合物,保持温度为50 ℃,控制搅拌桨搅拌转数为200 r/min,在无菌空气下水解48 h,水解结束后升温至110-120℃进行高温灭活,过滤除渣,经喷雾干燥后即制得牡丹肽粉,备用;

  步骤二、牡丹籽壳提取物的制备

  取步骤一收集的牡丹籽壳,加入其重量15倍的水,超声提取30-50min,收集提取液并浓缩至原体积的1/4,得到浓缩液,备用;向浓缩液中加入其体积4倍的无水乙醇,混合后静置6h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/3,喷雾干燥,即得到牡丹籽壳提取物,备用;

  步骤三、牡丹花提取物的制备

  取水分含量为20-30%的牡丹花瓣原材料,加入其重量5%的食盐,揉捻后采用水蒸气蒸馏,向蒸馏结束后的牡丹花中加入其重量的10倍的水,超声提取20min,然后将提取液浓缩至原体积的1/5,再向浓缩液中加入体积5倍的无水乙醇,混合静置4h,过滤,将得到的滤液浓缩至原体积的1/3,喷雾干燥,即得到牡丹花提取物,备用;

  步骤四、牡丹肽软胶囊的制备

  按照上述重量份数分别取步骤一得到的牡丹肽粉、步骤二得到的牡丹籽壳提取物和步骤三得到的牡丹花提取物,再取蜂蜡和牡丹籽油,备用;先向混合釜内加入牡丹籽油,然后边搅拌边加入牡丹肽粉,牡丹肽粉加入完成后再加入蜂蜡,搅拌均匀后依次加入牡丹籽壳提取物和牡丹花提取物,并在温度为70℃条件下搅拌25min,然后用200目研磨机研磨3次,在压力为20-30Mpa下均质2次,在140-160℃温度下采用超高温瞬间杀菌20秒,得到混合底料,备用;将混合底料采用常规方法填充在由明胶、甘油和水制备的软胶囊中,即完成牡丹肽软胶囊的制备。

  活性测试试验

  1. 抗肿瘤活性研究

  1) 试验材料

  胎牛血清,96孔培养板,恒温箱,RPM1640培养液。

  2)方法

  对上述实施例中得到的牡丹肽进行细胞毒活性测试,采用的方法为MTT法。

  3)试验步骤

  (1) 取对数生长期细胞,用含10%胎牛血清的RPM1640培养液,制成单细胞悬液5×104个/mL,将该悬液加到96孔培养板中,每孔加入1×104个细胞。培养24 h后,加入受试牡丹肽浓度分别为30 μg/mL、10 μg/mL。

  (2) 将平板在37 ℃,含5%CO2空气及100%湿度的恒温箱中孵育3天,去除培养液。

  (3) MTT用无血清的RPM1640培养液配成1 mg/mL溶液,每孔加100 μL,37℃温育4 h,使MTT还原为甲臢。

  (4) 吸出上层清液,加入150 μL DMSO使甲臢溶解,于ELISA仪570 nm处测OD值。

  4)试验结果

  表1 牡丹肽细胞毒活性实验数据(n=3)

  2. 抗氧化活性研究

  1) 试验材料

  牡丹肽粉末(制备方法见实施例1)。

  亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、吩嗪甲酯硫酸盐(PMS)、氯化硝基四氮唑(NBT)、无水乙醇、双氧水、2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、盐酸(HC1)均为分析纯,大豆卵磷脂(>90%)。

  2)方法

  (1) 清除超氧阴离子自由基(O-2·)的测定方法

  用pH8.0、浓度50mol/L的Tris-HCl缓冲液将牡丹肽稀释成不同的浓度梯度,各取1.5mL不同浓度牡丹肽溶液,然后依次加入0.5mL NBT (300μmol/L,以pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制),0.5mL NADH (468 μmol/L,以pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制),0.5mL PMS (60μmol/L,以pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制),混匀后在25℃中水浴5分钟,取出在波长560 nm处测定吸光度,空白对照组以缓冲液代替芪类溶液。

  E(O-2·)(%)=(1-)×100 (1)

  式中:E(O-2·)为牡丹小肽对O-2·的清除率(%);A1为芪类吸光度;A0为空白吸光度。

  (2)清除DPPH 自由基的测定方法

  将牡丹肽稀释成不同的浓度梯度,各取2 mL上述浓度的溶液于试管中,再加入2 mL浓度为0.04mg/mL的DPPH溶液,混合均匀,反应20分钟,3500 r/min离心分离10分钟,取上清液在波长517 nm处测其吸光度为Ai;另各取2mL上述浓度的牡丹肽溶液于试管中,分别加入无水乙醇2 mL,反应20分钟,3500 r/min离心分离10分钟,取上清液在波长517nm处测其吸光度为Aj;以2 mL 0.04 mg/mL DPPH 和2 mL无水乙醇反应作为参比,其吸光度记为A0。

  E(DPPH)(%)=(1-)×100 (2)

  式中:E(DPPH)为牡丹肽对DPPH自由基的清除率(%);A0为2mL DPPH溶液+2mL 无水乙醇的吸光度;Ai为2mL DPPH溶液+2mL牡丹肽溶液的吸光度;Aj为2mL无水乙醇+2mL牡丹肽的吸光度。

  (3)清除羟自由基(·OH)的测定方法

  将牡丹肽用双蒸水配制成不同浓度梯度,各取2mL上述浓度的溶液,依次加入2mL 6 mmol/L的FeSO4、2 mL 6 mmol/L的H2O2,混匀后静置10分钟,再加入2mL 6 mmol/L水杨酸,混匀,静置30分钟,在波长510 nm处测其吸光度记为Ai,当用双蒸水代替水杨酸时的吸光度记为Aj。空白对照组以双蒸水代替牡丹肽溶液吸光度记为A0。

  E(·OH)(%)= (1-)×100

  式中:E(·OH)为羟自由基的清除率(%);Ai为牡丹肽反应的吸光度;A0为空白吸光度;Aj为无水杨酸参加反应时芪类的吸光度。

  3)结果

  (1) 清除超氧阴离子自由基(O2-·)

  表2 牡丹肽清除超氧阴离子自由基(O2-·)活性(%)

  由表2可知,在所选质量浓度范围内,牡丹肽化合物具有清除超氧阴离子自由基的能力。随着质量浓度的增大,对超氧阴离子自由基的清除作用增强,呈现量效关系,总体效果比BHT一致。

  (2) 清除DPPH 自由基

  表3牡丹肽清除DPPH 自由基活性

  DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基,对其清除的效果表明受试药物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。由表3可知,牡丹肽化合物表现出很强的清除DPPH自由基的能力。

  (3) 清除羟自由基(·OH)

  表4 牡丹肽清除羟自由基(·OH)活性

  羟基自由基是最强的氧化剂,在生物体内几乎可以和所有细胞成分发生反应,对机体危害很大。由表4可知,牡丹肽清除·OH效果和BHT相比稍弱一些。

《牡丹肽 技术方法汇总三篇.doc》
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