犬血白蛋白说明 方法1:
静脉注射用犬血白蛋白提取检测系统
第一、技术领域
本实用新型涉及一种静脉注射用犬血白蛋白的分离纯化、检测系统。
第二、背景技术
静脉注射用犬血白蛋白是采集健康犬血浆，用现代生物技术分离、提取 并经病毒灭活处理精制而成的生物制剂，目前主要用硫酸铵盐析法或利凡诺 法分离纯化静脉注射用犬血白蛋白。该方法所需设备多，工艺繁琐，劳动强 度较大，易污染。
第三、发明内容
为减小上述问题本实用新型旨在提供这一种能够从犬血浆中提取并检测 静脉注射用犬血白蛋白的系统。
为达到上述目的，本实用新型提供如下技术方案：一种静脉注射用犬血 白蛋白提取检测系统，由依次连接的灭菌装置、混合过滤装置、恒温水浴装 置、检测装置、除菌装置和分装装置组成，所述混合过滤装置由多组相互连 接的混合装置和过滤装置组成。
优选地，所述灭菌装置包括纯水机和电热鼓风干燥箱。
进一步优选的，所述混合装置为电动搅拌机，所述电动搅拌机底座上设 有一承载装置，所述承载装置设有带软管和挤压头的塞子。
进一步优选地，所述过滤装置为上宽下窄的梯形腔体，其内部水平面设 有滤布，其下部设有软管。
进一步优选地，所述恒温水浴装置为电热恒温水浴锅。
进一步优选的，所述检测装置包括恒温箱、无菌培养基、超净台、雷磁 PH计、可见分光光度计和电泳仪。
进一步优选地，所述除菌装置为除菌过滤器，所述除菌过滤器上部设有一 带有软管和挤压头的塞子，下部设有软管。
进一步优选地，所述分装装置包括灌装机和电动轧盖机，所述灌装机设 有三叉管。
本实用新型减小了静脉注射用犬血白蛋白提取过程中的劳动强度，节约 时间，能够精确控制提取过程中的各个参数，提取的静脉注射用犬血白蛋白 的纯度在96%以上，是治疗急、危、难、重、病犬的特效生物制品。
第四、附图说明
图1是本实用新型优选实施例的组成结构图。
第五、具体实施方式
以下结合附图对本实用新型作进一步说明，本实用新型提供一种静脉注 射用犬血白蛋白提取检测系统，由纯水机和电热鼓风干燥箱、电动搅拌机、 过滤装置、电热恒温水浴锅、恒温箱、无菌培养基、超净台、可见分光光度 计、电泳仪、雷磁PH计、除菌过滤器、灌装机和轧盖机组成。
其中，纯水机和电热鼓风干燥箱用于对提取过程中所用容器进行清洗和 干燥处理;
电动搅拌机用于将分离液和分离剂充分混合;
过滤装置为上宽下窄的梯形腔体，其内部水平面设有滤布，其下部设有 软管，用于过滤混合溶液;
电动搅拌机底座上设有一承载装置，承载装置设有带软管和挤压头的塞 子，软管与过滤装置相连接;该系统包括4组相互连接的电动搅拌机和过滤 装置;
电热恒温水浴锅用于灭活犬血源中的病毒;
恒温箱、无菌培养基、超净台用于对提取的犬血白蛋白进行无菌检测;
可见分光光度计用于检测提取物的蛋白浓度;
电泳仪用于检测提取物的纯度;
雷磁PH计用于检测提取物的PH值;
除菌过滤器用于对检验合格的犬血白蛋白进行灭菌处理，杀灭操作过程 中可能混入的细菌。
灌装机和轧盖机用于对检测合格的犬血白蛋白进行分装。
使用时，将提取过程中所用容器用自来水清洗后，经纯水机中制备的去 离子水清洗三遍，在电热鼓风干燥箱干燥，保证容器无菌。将适量犬血浆倒 入电动搅拌机的承载装置中，加入饱和硫酸铵至29%饱和度，在电动搅拌机 中搅拌，放置，挤压承载装置顶部塞子的挤压头，使混合犬血浆从塞子的软 管导入过滤装置的滤布上过滤，所得滤液经过滤装置底部软管导入电动搅拌 机的承载装置中，向滤液中加入饱和硫酸铵至50%饱和度，重复上述搅拌机 混合，过滤装置过滤后，丢弃滤布上的沉淀物，向所得滤液中加入5%酚酞， 插入雷磁PH计，待雷磁PH计示值为4.2，重复上述搅拌机混合，过滤装置 过滤后，丢弃滤液，将所得沉淀倒入承载装置，加入2.2%辛酸钠和0.8%氯化 钠，插入雷磁PH计，待雷磁PH计示值为5.0，将上述滤液倒入清洗干燥过 的容器中，放入电热恒温水浴锅中，在60℃下加温10小时，以灭活犬血源 中的病毒，随后加入10%氯化钠静置，经过滤装置过滤后，丢弃滤液，将雷 磁PH计插入所得沉淀中用配置好的试剂调PH值，经透析后稀释。
以下对上述透析稀释后的提取物进行无菌检测、蛋白纯度检测和PH值测 试。将配制的无菌培养基放入37℃恒温箱预先培养一天，在超净台中向无菌 培养基中加入一定量提取物后，放入37℃恒温箱培养15天，观察培养基是 否合格;将雷磁PH计插入经无菌检测合格的提取物中，检测PH值是否合格; 取适量无菌检测和PH计检测均合格的提取物倒入可见分光光度计石英杯中 检测蛋白浓度;取适量提取物用电泳仪检测其纯度。全部合格后挤压除菌过 滤器的挤压头，使检测合格的犬血白蛋白从软管进入除菌过滤器，通过中部 滤芯材料除菌过滤后，从下部软管经灌装机的三叉管导入灌装机灌装并通过 电动轧盖机封装。
犬血白蛋白说明 方法2:
犬血清中白蛋白的提纯方法
醋酸钠缓冲液调节pH值至7.2，然后再搅拌过程中缓慢流加-23℃的95%乙醇，用量为澄清后血清体积的25%，流加速度约300ml/min，流加完毕后撤掉搅拌器，盖上桶盖反应14h;将反应液搅拌一下，16000rpm管式离心，收集上清，即为犬血白蛋白粗提液，称重并记录，单位为千克，数字记为M;
配置氯化钠溶液：同实施例1;
白蛋白粗提液桶上安装搅拌器，边搅拌犬血白蛋白粗提液边倒入氯化钠溶液，二者混合后氯化钠终浓度为0.85%(w/v)，倒入辛酸钠粉末，使终浓度在0.75%(w/v)，完全溶解后用pH值为4.0的HAC-NaAC缓冲溶液将pH值调至6.0，搅拌40分钟，将混合液分装入1L烧杯，每杯1L，用锡纸将杯盖封闭，置于68℃水浴锅中水浴1小时，回收水浴后混合液至洁净不锈钢桶内，置于-20℃冰柜中冷却16小时;将冷却后的混合液用台式离心机5100g离心30分钟，收集上清，将上清经过500KDa膜包超滤，去除在水浴反应过程中产生的白蛋白多聚体，膜下液即为澄清透明的白蛋白溶液;再用10KDa膜包进行浓缩，用注射用水洗涤去除溶液中氯化钠、辛酸钠等无关成分，收集膜上液，留取样品做检测，然后用0.22um除菌滤芯进行除菌保护，置于4℃保存。
3.结果
使用澄清后犬血清共218.4千克，血清中白蛋白的含量为25g/L，纯化后最终获得犬血白蛋白浓缩液20升，蛋白含量100g/L，取40ul浓缩液与5×Protein loading buffer混匀，煮沸10分钟，上样10ul，SDS-PAGE(10%分离胶，5%浓缩胶)灰度扫描结果白蛋白纯度高达95%，回收率(纯化白蛋白量/原料中白蛋白量)达36.4%。
对比例1
1.材料
犬血清(血清中白蛋白的含量为25g/L)、氯化钠、辛酸钠、冰醋酸、醋酸钠。
2.方法
将5瓶瓶装犬血清(500ml/瓶)放在融化间(10℃)间隔10cm摆放融化，待完全融化后经4500rpm离心15分种，取上清称重;用纯化水配制相同体积稀释液(1.2%w/w辛酸钠+1.6%w/w氯化钠)，将血清与稀释液等比混合于不锈钢桶内，安装搅拌器，低速搅拌，缓慢滴加-20℃95%乙醇，滴加的总体积为混合液体积的10%，再用pH值为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至6.3，分装入1L烧杯，每杯1L，用锡纸将杯盖封闭，置于60℃水浴锅中水浴45分种;水浴后用台式离心机5100g离心20分钟，上清经500KDa超滤收集膜下液，用注射用水洗涤去除溶液中氯化钠、辛酸钠等无关成分，膜下液经10KDa浓缩获得纯化液。
3.结果
使用血清原料3500ml，血清中白蛋白的含量为25g/L，回收白蛋白浓缩液700ml，蛋白含量为48mg/mL，回收率为37.84%，如图2泳道10所示白蛋白纯度为70%，内毒素40～80EU/mL，外检有严重乳光。
对比例1与实施例1相比，没有球蛋白等电点沉淀步骤，氯化钠和辛酸钠使用的终浓度等工艺参数也超出本方案范围，导致最终蛋白含量、纯度低，此外，外检有严重乳光问题出现，不符合注射生物制品要求。
对比例2
1.材料
犬血清(血清中白蛋白的含量为25g/L)、氯化钠、辛酸钠、冰醋酸、醋酸钠。
2.方法
将4瓶瓶装犬血清(500ml/瓶)放在融化间(10)间隔10cm摆放融化，待完全融化后经4500rpm离心15分种，取上清称重;缓慢滴加-20℃的95%乙醇353ml，再用pH值为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至7.0，置于-20℃冰箱沉淀2小时，然后离心取上清;1:1混入室温注射用水，称重，添加0.6%(w/w)辛酸钠、0.8%(w/w)氯化钠，边搅拌边用pH值为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至6.3，搅拌1小时，分装入1L烧杯，每杯1L，用锡纸将杯盖封闭，置于60℃水浴锅中水浴1小时;水浴后用台式离心机5100g离心20分钟，上清经500KDa超滤收集膜下液，称重并进行蛋白含量及纯化检测。
3.结果
使用血清2000ml血清中白蛋白的含量为25g/L，回收白蛋白浓缩液90.4ml，蛋白含量为100mg/mL，回收率为36.16%，如图3泳道8所示白蛋白纯度为82%。
对比例2同对比例1相比增加了一步低温乙醇(S1)沉淀，与对比例1相比，虽然提高了终产物白蛋白的纯度，降低了内毒素含量，但仍然达不到高纯度的要求。另外，本实验例发现，在热乙醇(S2)步骤中，辛酸钠的使用量不同是产生乳光的重要因素之一。
对比例3
1.材料
犬血清(血清中白蛋白的含量为25g/L)、氯化钠、辛酸钠、冰醋酸、醋酸钠。
2.方法
将50瓶瓶装犬血清(500ml/瓶)放在融化间(10)间隔10cm摆放融化，待完全融化后经4500rpm离心15分种，取上清称重;缓慢滴加-20℃的95%乙醇4413ml，再用pH值为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至7.0，置于-20℃冰箱沉淀2小时;离心取上清，将上清分为5份，分别以不同的比例混入室温注射用水，称重，添加0.6%(w/w)辛酸钠、0.8%(w/w)氯化钠，边搅拌边用pH值为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至6.3，搅拌1小时，分装入1L烧杯，每杯1L，用锡纸将杯盖封闭，置于60℃水浴锅中水浴1小时;然后水浴后用台式离心机5100g离心20分钟，上清经500KDa超滤收集膜下液，观察膜下液乳光情况。
3.结果
上清分别以不同比例混入室温注射用水后热乙醇法的乳光结果如表1所示，当上清与注射用水混合比例为1.2-1.6：1时，水浴离心后上清无乳光，为能够最大量的使用上清液进行水浴，提高效率，所以选择使用1.2-1.6：1作为上清混合注射用水的最加比例。
表1不用比例混合后热乙醇法乳光问题
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。
