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甾体生物碱制成的药物 相关内容汇总

2020-09-09 18:06:55

  甾体生物碱制成的药物 相关一:

  一类甾体皂苷元衍生物、其制备方法和用途

  第一、技术领域

  本发明属于医药技术领域,具体涉及具有抗血栓形成作用的甾体皂 苷元衍生物、其药物组合物以及其医药用途。

  第二 、技术背景

  血小板聚集和血栓形成是缺血性心脑损伤的重要原因。血小板活化、 黏附和聚集是动脉内血栓形成的始动因素之一,在动脉粥样硬化和冠脉事 件(不稳定型心绞痛、急性心肌梗死、心脏缺血性猝死)、中风等发病中 起着关键性作用。因此,抗血小板和抗凝治疗已成为减少临床缺血性事件 治疗的热点。口服抗血小板药物是现今最常处方的长期预防疗法,但因该 类药物的研究管线相对薄弱,目前临床仍缺乏能够长期使用的安全、有效 的药物。

  目前临床常用的抗血小板药物有如下几类:抑制血小板花生四烯酸代 谢的环氧化酶抑制剂-阿司匹林;作用于ADP受体的广谱抗血小板药物- 噻氯匹啶、氯吡格雷,作用于纤维蛋白原受体的药物:血小板表面GPIIb /IIIa受体拮抗剂如abciximab、依替非特(integrelin,eptifibatide)、替罗非 班(tirofiban)、拉米非班(lamifiban)等。

  阿司匹林是临床抗血小板首选药物,但其不能抑制凝血酶、ADP、胶 原以及儿茶酚胺等激动剂诱导的抗血小板聚集,长期用药中出现胃肠道毒 副作用(表浅黏膜糜烂、瘀斑、消化道出血、消化性溃疡等)以及阿司匹 林抵抗。

  后来的噻氯匹啶、氯吡格雷等广谱抗血小板药虽然部分克服了前述阿 司匹林的缺陷,但仍存在胃肠道反应、血脂水平改变和出血倾向等副作用 以及近来发现的氯吡格雷抵抗;糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂是目前已知作 用最强的一类抗血小板药物,目前几种GPIIb/IIIa受体拮抗剂都是静脉给 药为主,仅用于AMI或急性冠脉综合征的患者以及介入性心脏病领域,而 长期的抗血小板治疗和缺血性事件的二级预防要求口服有活性的制剂。

  甾体皂苷元(Steroidal saponins)是植物中一类重要的生物活性物质,自 发现以来主要作为合成甾体避孕药和激素类药物的原料。天然甾体在植物 体中多以糖苷的形式存在,现代药理学研究表明这些甾体皂苷类化合物普 遍具有降血糖、免疫调节、防治心脑血管疾病、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等 生物活性。已经有一些含有甾体皂苷类成分的药物用于临床治疗心脑血管 疾病,其中代表性的有地奥心血康、心脑舒通。甾体皂苷类成分分子量大, 口服吸收差,主要是经肠道菌群作用下代谢的产物吸收入血产生药理作 用。有文献报道(马海英,周秋丽等,中国医院药学杂质,2002,22(6), 323-325)地奥心血康的主成分黄山药总皂苷在肠道的主要代谢产物是薯 蓣皂苷元,对比试验表明薯蓣皂苷元较之黄山药总皂苷具有更好的降脂、 抗血小板聚集活性。说明薯蓣皂苷元是活性母体结构。因此,以这些活性 甾体母核为核心结构进行结构改造,很有可能发现新的抗动脉血栓形成药 物。

  第三、发明内容

  本发明提供具有抗血栓形成活性的薯蓣皂苷元衍生物,其活性较现有 的甾体皂苷类药物强,质量易于控制,活性与现有的抗血小板聚集药物相 当,而且克服了现有药物胃肠道副作用的缺陷,可适用于现有抗血小板聚 集药物不耐受的患者。

  本发明的另一个目的是提供通式I的抗血栓形成薯蓣皂苷元衍生物或 其药学上可接受的盐。

  本发明的又一个目的是提供通式I的薯蓣皂苷元衍生物或其药学上可 接受的盐,作为抗血栓形成药物,在心脑血管疾病预防和治疗中的应用。

  本发明的再一个目的是提供包含通式I系列化合物或其药学上可接受 的盐以及一种或多种药学上可接受的载体或赋型剂或稀释剂组成的药物 制剂。

  本发明还有一个目的是提供通式I系列化合物或其药学上可接受的盐 的制备方法。

  现结合本发明的目的对本发明逐一加以描述:

  本发明提供的甾体皂苷元衍生物及其药学上可接受的盐结构式如下:

  其中,R可以是-CO(CH2)1-3COOH、-SO3H、 -PO3H2、-(CH2)1-3SO3H、-(CH2)1-3PO3H2、马来酰基、富马酰基、桂 皮酰基、香豆酰基、阿魏酰基、水杨酰基、乙酰水杨酰基、双水杨酯酰 基、苯甲酰基、邻苯二甲酰基、烟酰基、4’-(乙酰水杨酰基)-阿魏酰基。

  当R为时,其中X可以为桂皮酰基、香豆酰基、 阿魏酰基、水杨酰基、乙酰水杨酰基、双水杨酸酯酰基、苯甲酰基、邻 苯二甲酰基、烟酰基、4’-(乙酰水杨酰基)-阿魏酰基。

  所述的甾体皂苷元衍生物以及药学上可接受的盐,R表示的取代基 中,优选CO(CH2)1-3COOH、-PO3H2、(CH2)1-3PO3H2、马来酰基、阿魏 酰基、乙酰水杨酰基、双水杨酸酯酰基,更优选-PO3H2、 CO(CH2)1-3COOH、阿魏酰基,更优选下列化合物:

  R为-COCH2COOH、乙酰水杨酰基、烟酰基、-PO3H2、4’-(乙酰 水杨酰基)-阿魏酰基的化合物,和

  R为时,X为肉桂酰基、阿魏酰基、肉桂酰基 的化合物。

  表1优选化合物

  编号 名称/结构式 DI01 3β-薯蓣皂苷元烟酸酯 DI02 3β-薯蓣皂苷元-(肉桂酰哌嗪)-乙酸酯 DI03 3β-薯蓣皂苷元丁二酸单酯 DI04 3β-薯蓣皂苷元丁二酸单酯钠盐 DI05 3β-薯蓣皂苷元阿魏酸酯 DI06 3β-薯蓣皂苷元乙酰水杨酸酯 DI09 3β-薯蓣皂苷元磷酸酯

  本发明所述甾体皂苷元衍生物及其药学上可接受盐的合成方法:

  采用已知的酯化方法,可以容易地从上文中限定的甾体皂苷元和有机 酸制得本发明的有机酸酯。也就是说,这种酯可以通过下列方法制备:在 一种催化剂如硫酸、对甲苯磺酸或三氟化硼存在下,通过脱水,使有机酸 与甾体皂苷元发生酯化反应;在一种催化剂如硫酸或氯化锌存在下,使有 机酸的酸酐与甾体皂苷元反应;或者,使有机酸的酰卤与甾体皂苷元反应。 这些方法中最好的一种是用有机酸酰卤与甾体皂苷元反应。如果起始的有 机酸是一种一元酸如烟酸、单或双取代的肉桂酸、苯甲酸,则可以按照下 述方法容易地制得所要的甾体皂苷元的有机酸酯,产率很高:先用一种卤 化剂把起始有机酸的羧基转变为酰卤基,然后用甾体皂苷元将所得酰基酯 化。酯化反应是在一种溶剂中,在一种脱卤化剂的存在下进行的,反应温 度为10~100℃。较好的卤化剂是亚硫酰氯、磺酰氯、苯甲酰氯、邻苯二 甲酰氯、氯化氢和溴化氢。酯化反应中使用的脱卤化剂适宜采用吡啶、喹 啉、三甲胺、三乙胺、三丙胺、三丁胺、镁和二甲基苯胺。

  当起始有机酸苯环上带有一个OH时,需要预先将有机酸的羟基酰化, 然后按如上所述将所得到的酸卤化和酯化。然后通过脱去前述酰基化的衍 生物酰基,即在氨、苛性碱或无机酸的浓水溶液中加热这种衍生物,就可 以制得每一种苯环上带有羟基的有机酸酯。

  使用一种酰化剂,可以容易地完成上述的酰化反应。这种酰化试剂的 例子有下列低级脂肪酸的酸酐或酰卤:乙酸、丙酸、丁酸或马来酸酐。

  以甾体皂苷元为起始原料与磷酰化试剂反应,如:三氯氧磷一三烷 基磷酸酯、焦磷酸酰氯、二苄基磷酸酯等制得其磷酸酯或其二苄基磷酸酯, 经柱层析(硅胶)反复纯化,后者在钯炭存在下与氢气反应可得其磷酸酯。 得到磷酸酯后,可以方便地制成各种盐,如钠盐、钾盐等。

  磺酸酯的制备是以甾体皂苷元为起始原料,与磺酰氯反应,经柱层析 反复分离,必要时用高效液相制备柱分离,得到磺酸酯,然后方便的制成 各种盐,如钠盐、铵盐等。

  与取代芳基酰卤,取代芳基磺酰卤,醋酐等反应,得到各类衍生物及 其盐。

  本发明所述的氨基酸盐是指生理性的20种L氨基酸之一,如谷氨酸、 天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸等等。

  所述无机盐是指分子中的酸性基团与锂、钠、钾、NH4+等离子生成 的盐;有机碱盐是指分子中的酸性基团与葡甲胺、氨基酸等有机碱生成的 盐。其中碱性氨基酸即精氨酸、赖氨酸、组氨酸等为优选有机碱。

  本发明还提供了含所述衍生物的药物组合物,使用本发明提供的任意 一种或几种薯蓣皂苷元衍生物或其药学上可接受的盐和药剂学可接受的 药用辅料,可以制备药物组合物。药剂学可接受的药用辅料包括稀释剂、 润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、溶剂等。

  本发明所述稀释剂包括但不限于淀粉、微晶纤维素、蔗糖、糊精、乳 糖、糖粉、葡萄糖、低分子右旋糖苷、高岭土、氯化钠、甘露醇等;所述 润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、硼酸、氯化钠、油酸钠、DL-亮 氨酸、月桂醇硫酸钠、聚乙二醇4000-6000、泊洛沙母等;所述粘合剂包 括但不限于水、乙醇、淀粉浆、糖浆、明胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤 维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、茄替胶、聚乙烯吡咯烷酮等;所述崩 解剂包括但不限于淀粉、羧甲基淀粉钠、泡腾混合物即碳酸氢钠和枸橼酸、 酒石酸、低取代羟丙基纤维素等;所述稳定剂包括但不限于多糖如金合欢 胶、琼脂、藻酸、瓜耳胶、黄芪胶、丙烯酸酸树脂、纤维素醚和羧甲基甲 壳酯等;所述溶剂包括但不限于林格式溶液、水、磷酸盐缓冲液、平衡的 盐溶液等;

  活性成份与辅料成份的组合比例根据制剂的不同而不同,活性成份的 剂量可以在0.01mg/kg-50mg/kg,根据治疗的目的不同,剂量适当的加以 调整。所述的组合物根据治疗需要的不同,可以制成各种不同的制剂,包 括各种固体口服制剂、液体口服制剂、注射剂、膜剂、气雾剂等。药剂学 可接受的口服剂固体制剂有:普通片剂、分散片、缓控释、肠溶片、颗粒、 胶囊、滴丸、散剂等等,口服液体制剂有口服液、乳剂;注射剂有:小水 针、输液、冻干粉针等等。各制剂可以根据常规的工艺制备而成。

  药理学作用:

  下面详细描述本发明化合物抗血栓形成作用的药理学试验结果。

  1.材料:

  1.1试剂:

  肝素钠:天津市化学试剂批发部经销,批号:891125。

  氯化钠:天津市塘沽化学试剂厂产品。

  羧甲基纤维素钠:天津市福晨化学试剂厂产品,批号:20050407。

  吐温80:天津市精细化学品有限公司产品,批号:920311。

  1.2药物

  TY606系列衍生物:TY606-DI01~09,由TY606课题组提供。

  阿司匹林:为组内留样。配制方法为180mg+10d吐温+1%CMCNa至 18ml。

  1.3动物

  Wistar大鼠,雄性,体重260~320g,购自中国医学科学院放射医学研 究所。

  1.4仪器

  BS 124S型电子天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。

  HZS-D水浴震荡器:哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品。

  2.方法:

  将大鼠按体重平均分为7组,分别为模型组,阳性药阿司匹林组,受 试药TY-606五个组。口服给药100mg/kg,连续给药3次,末次给药后1小时 麻醉动物(戊巴比妥钠,54mg/kg,ip)仰卧位固定,分离右颈总动脉和 左颈外静脉。在聚四氟乙烯管的中段放入一根长6cm的丝线。以肝素生理 盐水溶液(50u/ml)充满聚四氟乙烯管。当聚四氟乙烯管的一端插入左颈 外静脉后,由聚四氟乙烯管准确地注入50u/kg的肝素抗凝,然后再将聚四 氟乙烯管的另一端插入右颈总动脉。打开动脉夹,血液从右颈总动脉流至 聚四氟乙烯管内,返回左颈外静脉。开放血流15min后中断血流,迅速取 出丝线称重,总重量减去丝线重量即得血栓湿重。

  3.结果

  表2薯蓣皂苷元衍生物抗血栓形成活性

  **与模型组比较P<0.01,*P<0.05

  结论:所试薯蓣皂苷元衍生物在大鼠动静脉旁路血栓形成模型上均显 示抗血栓形成活性。

  实施例

  下面结合实施例对本发明做进一步的说明。实施例仅为解释性的,决 不意味着它以任何方式限制本发明的范围。本发明的化合物采用核磁共振 波谱(1HNMR/13CNMR)、质谱等技术手段确证其结构。

  实施例13β-苯甲酰薯蓣皂苷元的合成

  diosgenin 10.4g(25mmol),在冰水浴下溶于200mL吡啶中,置于 500mL三颈瓶中,电磁搅拌下滴加苯甲酰氯5.8mL(50mmol),自然升 至室温,反应24小时。将反应溶液倒入1000mL H2O中,用CH2C12萃 取,合并有机相,依次用水、稀盐酸、饱和NaHCO3溶液洗涤,无水 MgSO4干燥,滤过,减压(60℃)蒸干滤液,得到略带黄色的产物。用无 水EtOH重结晶,干燥,称重10.6g,收率81.8%。

  衍生物波谱数据:

  ESI-MS:519[M+H]+

  NMR:1HNMR(400MHZ,CDCl3)δ:0.85(3H,s,H-18),1.02(3H,s,H -19),1.15(3H,d,J=7.2HZ,H-21),0.69(3H,d,J=6.0HZ,H-27),5. 03(1H,m,H-3),5.38(1H,d,J=4.8HZ,H-6),4.54(1H,q,H-16),3.5 8(1H,dd,J=10.4,3.2HZ,26-αH),3.50(1H,t,26-βH),苯甲酰基:8. 25(2H,dd,J=8,1.2HZ,H-3′,7′),7.56(1H,t,H-5′),7.47(2H,t,J= 8,7.2HZ,H-4′,6′);13CNMR(100MHZ,CDCl3)δ:37.2(C-1),29.3(C-2),74.8 (C-3),38.5(C-4),139.9(C-5),122.8(C-6),32.2(C-7),31.8(C-8),50.1(C-9),37.0 (C-10),21.1(C-11),39.8(C-12),40.5(C-13),56.6(C-14),32.2(C-15),81.1(C-16), 62.9(C-17),16.4(C-18),19.4(C-19),42.0(C-20),15.0(C-21),109.3(C-22),31.6 (C-23),28.1(C-24),30.6(C-25),66.9(C-26),17.3(C-27),苯甲酰基:166.0(C-1′), 131.4(C-2′),128.9(C-3′,6′),129.9(C-4′,7′),133.3(C-5′)

  实施例23β-薯蓣皂苷元丁二酸单酯(DI 103)及其盐的制备

  1)3β-薯蓣皂苷元丁二酸单酯的制备:

  称取diosgenin 4.14g(10mmol),丁二酸酐2g(20mmol),置于 250mL三颈瓶中,溶于50mL吡啶中,溶解。置于带电磁搅拌装置水浴 锅中,油浴温度80℃下反应,TLC(PE∶EtOAc=3∶1 v∶v)检测反应进 程,发现反应物基本上不再转化时,停止反应。将反应液于80℃下减压 蒸出大量吡啶,溶液呈红棕色,加入适量丙酮,置于冰箱中冷藏,放置 半日,有略带棕黄色的结晶析出,采用常压硅胶柱层析(以PE∶EtOAc 5∶1 为流动相)方法分离纯化,得0.79g产物,收率为15.4%。

  衍生物波谱数据:

  ESI-MS:515[M+H]+537[M+Na]+

  NMR:1HNMR(400MHZ,CDCl3)δ:0.83(3H,s,H-18),0.94(3H,s, H-19),1.13(3H,d,J=7.2HZ,H-21),0.69(3H,d,J=6.8HZ,H-27),4.84(1 H,m,H-3),5.29(1H,d,J=4.8HZ,H-6),4.54(1H,q,H-16),3.58 (1H,dd,J=10.4,3.2HZ,26-αH),3.49(1H,t,26-βH),2.91(4H,m,H- 2′,3′);13CNMR(100MHZ,CDCl3)δ:37.2(C-1),29.3(C-2),74.2(C-3),38.5 (C-4),140.0(C-5),122.6(C-6),32.2(C-7),31.8(C-8),50.1(C-9),36.9(C-10),21.0 (C-11),39.9(C-12),40.5(C-13),56.6(C-14),32.2(C-15),81.1(C-16),62.9(C-17), 16.4(C-18),19.3(C-19),42.0(C-20),15.1(C-21),109.3(C-22),31.6(C-23),28.1 (C-24),30.6(C-25),66.9(C-26),17.3(C-27),174.9(C-1′),30.2(C-2′),29.9(C-3′), 172.4(C-4′)

  2)3β-薯蓣皂苷元丁二酸单酯钠盐(DI104)的制备:

  将上述3β-薯蓣皂苷元丁二酸单酯0.3g,溶于适量乙醇中,滴加50 %氢氧化钠溶液,调PH值为8~8.5,过滤,分取沉淀,干燥,即得3β- 薯蓣皂苷元丁二酸单酯钠盐。

  实施例33β-薯蓣皂苷元磺酸酯及其盐的制备

  1)3β-薯蓣皂苷元磺酸酯的制备

  在装有电动搅拌和冷凝管的250mL三颈瓶中加入1.2g薯蓣皂苷 元,40mL新蒸吡啶,35℃水浴加热,开动搅拌,使完全溶解,在搅拌 下,向瓶中滴入4mL氯磺酸,20min滴完,反应剧烈,产生大量白色烟 雾,用碱液回收,加毕,继续搅拌,TLC(CH2Cl2∶MeOH∶H2O=10∶2∶1 HCOOH 1d)检测反应进程。反应30min左右比较完全。放置冰箱内冷 藏过夜,析出白色结晶,过滤,冰水洗,干燥称重0.3g,收率为21%。

  衍生物波谱数据:

  ESI-MS:493[M+H]+

  NMR:1HNMR(400MHZ,CDCl3)δ:0.81(3H,s,H-18),0.94(3H,s,H -19),1.13(3H,d,J=7.2HZ,H-21),0.68(3H,d,J=6.8HZ,H-27),4.82(1 H,m,H-3),5.30(1H,d,J=4.8HZ,H-6),4.54(1H,q,H-16),3.5 8(1H,dd,J=10.4,3.2HZ,26-αH),3.49(1H,t,26-βH);13CNMR(100M HZ,CDCl3)δ:37.6(C-1),29.9(C-2),77.6(C-3),39.9(C-4),141.0(C-5),121.9(C- 6),32.3(C-7),31.8(C-8),50.2(C-9),36.9(C-10),21.1(C-11),40.4(C-12),40.5(C- 13),56.6(C-14),32.2(C-15),81.1(C-16),62.9(C-17),16.4(C-18),19.4(C-19),42. 0(C-20),15.0(C-21),109.3(C-22),31.7(C-23),29.3(C-24),30.6(C-25),66.9(C-2 6),17.3(C-27)

  2)3β-薯蓣皂苷元磺酸酯铵盐(DI108)的制备

  上述3β-薯蓣皂苷元磺酸酯溶于95%乙醇中,用浓氨水溶液调PH值 为8,即得3β-薯蓣皂苷元磺酸酯铵盐。

  实施例43β-薯蓣皂苷元氯乙酸酯的合成

  称取diosgenin 6.21g(15mmol),一氯乙酸4.3g(45mmol),置于 500mL圆底烧瓶中,加入200mL无水CH2Cl2,溶解,在冰浴冷却下, 加入7.0g(30mmol)DCC和20mg DMAP,升至室温搅拌,反应过夜, 停止搅拌,过滤。滤液用2%NaOH萃取两次(60mL×2),水洗三次(60 mL×3),CH2Cl2层无水MgSO4干燥,滤过,滤液浓缩至干,无水乙醇 重结晶。减压干燥,得2g产物,收率为81.6%。

  衍生物波谱数据:

  ESI-MS:491[M+H]+

  NMR:1HNMR(400MHZ,CDCl3)δ:0.767(3H,s,H-18),1.03(3H,s, H-19),0.96(3H,d,J=7.2HZ,H-21),0.765(3H,d,J=6.8HZ,H-27),4.68(1H, m,H-3),5.37(1H,d,J=4.8HZ,H-6),4.39(1H,q,H-16),3.45(1H,dd, J=10.4,3.2HZ,26-αH),3.33(1H,t,26-βH),4.00(2H,s,H-2′);13CNMR(100 MHZ,CDCl3)δ:37.8(C-1),28.8

  (C-2),76.1(C-3),39.7(C-4),139.2(C-5),122.8(C-6),32.0(C-7),31.4(C-8),50.0( C-9),36.7(C-10),20.8(C-11),40.3(C-12),41.2(C-13),56.4(C-14),31.8(C-15),8 0.8(C-16),62.1(C-17),16.3(C-18),19.3(C-19),41.6(C-20),14.5(C-21),109.3(C -22),31.4(C-23),27.6(C-24),30.3(C-25),66.8(C-26),17.1(C-27),166.7 (C-1′),36.8(C-2′)

  实施例53β-薯蓣皂苷元哌嗪乙酸酯(DI107)

  称取实施例4中得到的薯蓣皂苷元氯乙酸酯0.49g(1mmol),六水 哌嗪1.95g(10mmol),置于250mL圆底烧瓶中,加丙酮25mL,置 于带有电磁搅拌装置和冷凝管的水浴锅中,于55℃下回流搅拌,TLC (CH2Cl2∶MeOH=10∶1)检测反应进程,反应25min。停止反应,冷却, 常压过滤,蒸干滤液,残渣加入50mL水,超声溶解,放置,析出白色 粉末状沉淀,抽滤,得白色粉末,减压干燥,得0.3g产物,收率为45 %。

  衍生物波谱数据:

  ESI-MS:541[M+H]+

  NMR:1HNMR(400MHZ,CDCl3)δ:0.767(3H,s,H-18),1.02(3H,s, H-19),0.94(3H,d,J=7.2HZ,H-21),0.765(3H,d,J=6.8HZ,H-27),4.6 3(1H,m,H-3),5.34(1H,d,J=4.8HZ,H-6),4.38(1H,q,H-16), 3.44(1H,dd,J=10.4,3.2HZ,26-αH),3.35(1H,t,26-βH),3.15(2H,s, H-2′),2.94(4H,m,H-1″,4″),2.56(4H,m,H-2″3″);13CNMR(100MH Z,CDCl3)δ:36.9(C-1),28.8(C-2),74.3(C-3),38.1(C-4),139.5(C-5),122.5(C-6), 32.0(C-7),31.4(C-8),49.9(C-9),36.7(C-10),20.8(C-11),39.8(C-12),40.2(C-13), 56.4(C-14),31.8(C-15),80.8(C-16),62.1(C-17),16.3(C-18),19.3(C-19),41.6(C -20),14.5(C-21),109.2(C-22),31.6(C-23),27.8(C-24),30.3(C-25),66.8(C-26),1 7.2(C-27),169.6(C-1′),60.1(C-2′),53.6(C-1″4″),45.6(C-2″3″)

  实施例63β-薯蓣皂苷元水杨酸酯的合成

  称取diosgenin 8.28g(20mmol),水杨酸5.52g(40mmol),置于 500mL圆底烧瓶中,加200mL无水CH2Cl2,溶解。在冰浴冷却下加入 DCC 9.28g(40mmol)和DMAP 20mg,在室温下反应6hr,停止反应。 反应液过滤,用拌样硅胶(80-100目)拌样,经硅胶柱层析(PE-EtOAc =40∶1为流动相)分离,得到白色粉末,干燥,称重,得2.5g产物,收 率为18.4%。

  衍生物波谱数据:

  ESI-MS:535[M+H]+

  NMR:1HNMR(400MHZ,CDCl3)δ:0.77(3H,s,H-18),1.02(3H,s,H -19),0.96(3H,d,J=7.2HZ,H-21),0.78(3H,d,J=6.0HZ,H-27),4.87(1 H,m,H-3),5.41(1H,d,H-6),4.40(1H,q,H-16),3.45(1H,dd,J= 10.4,3.2HZ,26-αH),3.36(1H,t,26-βH),7.82(1H,dd,J=8.4,1.6H Z,H-4′),6.94(1H,dd,J=8.4,1.6HZ,H-7′),7.42(1H,ddd,J=8.4,1.2H Z,H-5′),6.85(1H,ddd,J=8,1.2HZ,H-6′),10.87(1H,s,3′-OH);13C NMR(100MHZ,CDCl3)δ:36.9(C-1),28.8(C-2),74.3(C-3),38.1(C-4),139.3(C- 5),122.8(C-6),32.0(C-7),31.4(C-8),50.0(C-9),36.7(C-10),20.8(C-11),39.8(C- 12),40.2(C-13),56.4(C-14),31.8(C-15),80.8(C-16),62.1(C-17),16.3(C-18),19. 3(C-19),41.6(C-20),14.5(C-21),109.2(C-22),31.6(C-23),27.8(C-24),30.3(C-2 5),66.8(C-26),17.2(C-27),169.6(C-1′),112.9(C-2′),161.7(C-3′),117.5(C-4 ′),135.5(C-5′),118.9(C-6′),129.9(C-7′)

  实施例73β-薯蓣皂苷元肉桂酸酯的合成

  称取diosgenin 8.28g(20mmol),肉桂酸5.92g(40mmol),置于 500mL圆底烧瓶中,加350mL无水CH2Cl2,溶解。在冰浴冷却下加入 DCC 9.28g(40mmol)和DMAP 40mg,在室温下反应过夜,TLC(PE∶ EtOAc=9∶1 v∶v)检测反应进程,待反应比较完全,过滤,滤液蒸干,得 到白色粉末,干燥称重得7.32g产物,收率为67.3%。

  衍生物波谱数据:

  ESI-MS:541[M+H]+

  NMR:1HNMR(400MHZ,CDCl3)δ:0.79(3H,s,H-18),1.05(3H,s,H -19),0.95(3H,d,J=7.2HZ,H-21),0.78(3H,d,J=6.0HZ,H-27),4.73(1 H,m,H-3),5.38(1H,d,H-6),4.39(1H,q,H-16),3.44(1H,dd,J= 10.4,3.2HZ,26-αH),3.36(1H,t,26-βH),6.40(1H,d,J=16HZ,H-2′), 7.65(1H,d,J=16HZ,H-3′),7.49(2H,t,H-5′,9′),7.35(3H,t,H-6 ′,7′,8′);13CNMR(100MHZ,CDCl3)δ:36.9(C-1),28.8(C-2),73.9(C-3),38. 1(C-4),139.7(C-5),122.4(C-6),32.0(C-7),31.4(C-8),50.0(C-9),36.7(C-10),20. 8(C-11),39.8(C-12),40.2(C-13),56.4(C-14),31.8(C-15),80.7(C-16),62.1(C-1 7),16.3(C-18),19.3(C-19),41.6(C-20),14.5(C-21),109.2(C-22),31.6(C-23),27. 8(C-24),30.3(C-25),66.8(C-26),17.2(C-27),166.3(C-1′),118.7(C-2′),144. 4(C-3′),134.5(C-4′),128.8(C-5′,9′),128.0(C-6′,8′),130.1(C-7′)

  实施例83β-薯蓣皂苷元乙酰水杨酸酯(DI106)的合成

  称取3β-水杨酸薯蓣皂苷元酯107mg(0.2mmol),置于100mL圆 底烧瓶中,加入20mL吡啶,溶液混浊,置于电磁搅拌器上。冰浴冷却 下,搅拌下滴加3mL乙酸酐,升至室温反应过夜,TLC(PE∶EtOAc= 9∶1v∶v)检测,待反应完全,停止搅拌,反应液倾入50mL冰水中,析 出白色粉末,悬浮于水面,布氏漏斗抽滤,水洗沉淀除去吡啶。干燥称 重得70mg产物,收率为60%。编号Dio-3-10。

  衍生物波谱数据:

  ESI-MS:599[M+Na]+

  NMR:1HNMR(400MHZ,CDCl3)δ:0.77(3H,s,H-18),1.02(3H,s,H -19),0.96(3H,d,J=7.2HZ,H-21),0.78(3H,d,J=6.0HZ,H-27),4.87(1 H,m,H-3),5.41(1H,d,H-6),4.40(1H,q,H-16),3.45(1H,dd,J= 10.4,3.2HZ,26-αH),3.36(1H,t,26-βH),8.00(1H,dd,J=8.4,1.6 HZ,H-4′),7.52(1H,ddd,J=8.4,1.2HZ,H-5′),7.30(1H,ddd,J=8.4, 1.2HZ,H-6′),7.06(1H d,J=8HZ,),2.33(3H,s,H-2″);13CNMR(1 00MHZ,CDCl3)δ:37.0(C-1),28.8(C-2),74.6(C-3),38.1(C-4),139.5(C-5),122. 7(C-6),32.0(C-7),31.4(C-8),49.9(C-9),36.8(C-10),20.8(C-11),39.7(C-12),40. 2(C-13),56.4(C-14),31.8(C-15),80.7(C-16),62.1(C-1),16.3(C-18),19.4(C-19), 41.6(C-20),14.5(C-21),109.2(C-22),31.4(C-23),27.8(C-24),30.3(C-25),66.8 (C-26),17.1(C-27),169.5(C-1′),123.7(C-2′),150.5(C-3′),124.0(C-4′),133. 6(C-5′,9′),125.9(C-6′,8′),131.7(C-7′),163.9(C-1″),21.1(C-2″)

  实施例93β-薯蓣皂苷元-(肉桂酰哌嗪)-乙酸酯(DI102)的合成

  肉桂酰氯的合成:称取肉桂酸3.7g(25mmol),置于250mL干燥 三颈瓶中,缓慢加入5mL SOCl2,滴加1滴吡啶,置于带有冷凝装置的 电磁搅拌的油浴中缓慢加热至65℃,反应45min,停止反应。减压蒸出 过量SOCl2,密闭放置数分钟后析出结晶,丙酮快速洗去带色物质,得 肉桂酸酰氯衍生物。

  肉桂酸哌嗪乙酸薯蓣皂苷元酯的合成:称取哌嗪乙酰薯蓣皂苷元酯 270mg(0.5mmol)置于50mL圆底烧瓶中,加入6mL无水CH2Cl2, 溶解,在冰水浴冷却下滴加肉桂酰氯的CH2Cl2溶液,加入5mg DMAP, 室温下搅拌反应过夜。反应液用水萃取两次(30mL×2),将CH2Cl2层 蒸干,干燥称重,得220mg产物,收率65.4%。

  衍生物波谱数据:

  ESI-MS:671[M+H]+

  NMR:1HNMR(400MHZ,CDCl3)δ:0.79(3H,s,H-18),1.02(3H,s,H -19),0.95(3H,d,J=7.2HZ,H-21),0.78(3H,d,J=6.0HZ,H-27),4.66(1 H,m,H-3),5.36(1H,d,H-6),4.38(1H,q,H-16),3.46(1H,dd,J= 10.4,3.2HZ,26-αH),3.38(1H,t,26-βH),3.39(2H,s,H-2′),3.83(4H,br. s,H-1″,4″),2.83(4H,br.s,H-2″3″),6.83(1H,d,J=15.6HZ,H-2′″),7. 66(1H,d,J=15.6HZ,H-3′″),7.48(2H,m,H-5′″,9′″),7.36(3H,m, H-6′″,7′″,8′″);13CNMR(100MHZ,CDCl3)δ:36.8(C-1),28.7(C-2),75. 6(C-3),37.9(C-4),139.1(C-5),122.7(C-6),32.0(C-7),31.5(C-8),49.8(C-9),36.6 (C-10),20.7(C-11),39.6(C-12),40.2(C-13),56.4(C-14),31.8(C-15),80.7(C-16), 62.1(C-1),16.2(C-18),19.2(C-19),41.6(C-20),14.5(C-21),109.2(C-22),31.5(C -23),27.6(C-24),30.3(C-25),66.7(C-26),17.1(C-27),165.4(C-1′),57.4(C-2 ′),哌嗪环:52.0,44.4,40.7(C-1″,2″,3″,4″),桂皮酰基:166.8 (C-1′″),116.2(C-2′″),143.6(C-3′″),134.9(C-4′″),128.6(C-5′″, 9′″),127.7(C-6′″,8′″),130.2(C-7′″)

  实施例103β-薯蓣皂苷元阿魏酸酯(DI105)的合成

  乙酰阿魏酸的合成:称取阿魏酸9.7g(50mmol),置于500mL三 颈瓶中,加入200mL吡啶,溶解,置于电磁搅拌器上,滴加乙酸酐9mL (100mmol),TLC(CH2Cl2∶MeOH=20∶1 v∶v)检测反应进程,反应 12hr,停止反应。将反应液倾入水中,用CH2Cl2萃取,有机层依次用 稀盐酸、饱和NaHCO3溶液洗涤,无水MgSO4干燥,滤过,减压(60℃) 蒸干滤液,得10.2g白色粉末。收率为84.4%。

  乙酰阿魏酸酰氯的合成:称取乙酰阿魏酸酯1.2g(5mmol),缓慢 加入5mL SOCl2,滴加一滴吡啶,置于带有冷凝装置的电磁搅拌器上, 在油浴中缓慢加热至65℃,反应约60min,停止反应。反应液减压蒸干, 所得粉末略带黄色,用丙酮洗涤、纯化,得到白色粉末。

  乙酰阿魏酸薯蓣皂苷元酯的合成:乙酰阿魏酰氯500mg(1.9mmol), 溶于无水CH2Cl2,将diosgenin 500mg(1.2mmol),溶于少量无水吡啶 中,在冰浴冷却下,逐滴加入到乙酰阿魏酰氯的CH2Cl2溶液中,室温 下,搅拌反应,TLC(PE∶EtOAc=3∶1 v∶v)检测反应进程,反应24hrs。 反应液中加入少量水,减压蒸出CH2Cl2,残渣加入适量冰水,有白色粉 末析出,抽滤。所得粉末经常压硅胶柱层析,以PE∶EtOAc=6∶1为流 动相,分离纯化,得产物20mg,收率为2.1%。编号Dio-3-21。

  衍生物波谱数据:

  ESI-MS:633[M+H]+

  NMR:1HNMR(400MHZ,CDCl3)δ:0.79(3H,s,H-18),1.07(3H,s,H -19),0.95(3H,d,J=7.2HZ,H-21),0.78(3H,d,J=6.0HZ,H-27),4.74(1 H,m,H-3),5.41(1H,d,H-6),4.40(1H,q,H-16),3.46(1H,dd,J= 10.4,3.2HZ,26-αH),3.38(1H,t,26-βH),6.36(1H,d,J=15.6HZ,H-2′), 7.62(1H,d,J=16HZ,H-3′),7.10(1H,s,H-5′),7.11(1H,d,J=7.6HZ, H-8′),7.04(1H,d,J=8.4HZ,H-9′),3.86(3H,s,H-1″),2.32(3H,s,H- 3″);13CNMR(100MHZ,Pyridine-d5)δ:37.0(C-1),28.8(C-2),74.1(C-3),38.2(C -4),139.7(C-5),122.5(C-6),32.1(C-7),31.4(C-8),49.9(C-9),36.8(C-10),20.8(C -11),39.7(C-12),40.3(C-13),56.4(C-14),31.8(C-15),80.8(C-16),62.1(C-1),16. 3(C-18),19.4(C-19),41.6(C-20),14.5(C-21),109.3(C-22),31.4(C-23),27.9(C-2 4),30.3(C-25),66.8(C-26),17.1(C-27),166.2(C-1′),118.9(C-2′),143.7(C- 3′),133.5(C-4′),121.2(C-5′),151.4(C-6′),141.3(C-7′),111.2(C -8′),111.2(C-9′),55.9(C-1″),168.7(C-2″),20.8(C-3″)

  实施例113β-薯蓣皂苷元-(乙酰水杨酰哌嗪)-乙酸酯

  中间体3β-哌嗪乙酸薯蓣皂苷元酯的合成同实施例4。

  乙酰水杨酸酰氯的合成:称取乙酰水杨酸2.16g(12mmol),置于 250mL三颈瓶中,加入10mL无水CH2Cl2,2mL SOCl2(理论上9g 乙酰水杨酸/5mL SOCl2),滴加1滴吡啶,于油浴上缓慢加热升温至60℃, 反应1hr,停止反应,减压浓缩,加入适量甲苯,浓缩,带出残留的SOCl2, 得黄色油状物,密闭待用。

  3β-乙酰水杨酰基哌嗪乙酸薯蓣皂苷元酯的合成:称取哌嗪乙酸薯蓣 皂苷元酯2.16g(4mmol),置于250mL圆底烧瓶,加入10mL无水 CH2Cl2;将乙酰水杨酸酰氯溶解在无水CH2Cl2中,在冰浴冷却下,缓 慢滴入圆底烧瓶中,反应3hr后停止反应,将反应液倾入水中,分取有 机层蒸干,加入适量丙酮充分洗涤,过滤,得白色粉末,干燥称重得1.5 g产物,收率为23.4%,

  衍生物波谱数据:

  ESI-MS:703[M+H]+

  NMR:1HNMR(400MHZ,CDCl3)δ:0.75(3H,s,H-18),1.02(3H,s,H -19),0.96(3H,d,J=7.2HZ,H-21),0.75(3H,d,J=6.0HZ,H-27),4.70(1 H,m,H-3),5.35(1H,d,H-6),4.40(1H,q,H-16),3.45(1H,dd,J= 10.4,3.2HZ,26-αH),3.34(1H,t,26-βH),3.83(2H,s,H-2′),哌嗪环: 4.72(1H,br.s),4.14(1H,br.s),3.82(2H,br.s),3.50(2H,br.s),3. 38(2H,br.s);乙酰水杨酰基:7.45(1H,m),7.27(2H,m),7.12(1H, d,J=8.4HZ),2.29(3H,s,AcO-);13CNMR(100MHZ,Pyridine-d5)δ:36. 7(C-1),28.7(C-2),76.7(C-3),37.8(C-4),138.8(C-5),123.1(C-6),32.1(C-7),31.3 (C-8),49.8(C-9),36.6(C-10),20.7(C-11),39.6(C-12),40.2(C-13),56.3(C-14),31. 7(C-15),80.7(C-16),62.0(C-1),16.2(C-18),19.2(C-19),41.5(C-20),14.4(C-21), 109.2(C-22),31.3(C-23),27.5(C-24),30.2(C-25),66.8(C-26),17.1(C-27),163. 5(C-1′),55.2(C-2′),哌嗪环:51.0,44.0,38.4;乙酰水杨酰基:169.5, 123.0,147.5,126.1,131.3,127.4,127.7,21.0,166.8

  实施例123β-薯蓣皂苷元磷酸酯(DI109)的合成

  在冰浴下,将8ml无水吡啶加入圆底烧瓶中,再加入0.05ml(9.9mmol) 三氯氧磷,最后在1min内加入含薯蓣皂苷元1.0g的吡啶溶液,冰浴下反应 4hr,反应毕,将反应液倾入20ml冰水中,放置过夜,加13%盐酸使产物 析出,抽滤,水洗,得白色固体,在无水乙醇中热溶,趁热过虑,滤液中 加入40ml蒸馏水,放置冷却后,抽滤,干燥,得目标产物0.15g,收率15 %。

  13CNMR(100MHZ,CDCl3)δ:36.7(C-1),27.2,27.3(C-2),83.7(C-3),35.3,3 5.4(C-4),138.8(C-5),123.1(C-6),32.1(C-7),31.3(C-8),49.8(C-9),36.6(C-10),2 0.7(C-11),39.6(C-12),40.2(C-13),56.3(C-14),31.7(C-15),80.7(C-16),62.0(C-1), 16.2(C-18),19.2(C-19),41.5(C-20),14.4(C-21),109.2(C-22),31.3(C-23),27.5(C -24),30.2(C-25),66.8(C-26),17.1(C-27)

  实施例133β-薯蓣皂苷元烟酸酯(DI101)

  烟酸酰氯的合成:称取烟酸2.6g,置于250ml三颈瓶中,加入吡啶 20ml,在45℃以下滴加2ml POCl3,滴加时温度升高很快,用冰浴冷却, 滴加完毕后,在45℃下反应1小时,即得。

  烟酸薯蓣皂苷元酯的合成:称取diosgenin 1g,加入上面烟酸酰氯的 反应瓶中,温度升高至70℃,保温3小时。停止反应后,向三颈瓶中加 入适量水,有粉末析出,放冷,抽滤,得淡黄色粉末。干燥后称重1g, 收率80%。编号Dio-3-28.

  ESI-MS:520[M+H]+

  NMR:1HNMR(400MHZ,CDCl3)δ:0.80(3H,s,H-18),1.02(3 H,s,H-19),0.94(3H,d,J=7.2HZ,H-21),0.79(3H,d,J=6.8HZ,H- 27),4.90(1H,m,H-3),5.42(1H,d,J=4.8HZ,H-6),4.40(1H,q, H-16),3.47(1H,dd,J=10.4,3.2HZ,26-αH),3.37(1H,t,26-βH),烟酸 基团:0.98(1H,q),8.34(1H,d,J=8HZ),8.34(1H,d,J=8 HZ),8.77(1H,d,J=4.4HZ),9.22(1H,s);13CNMR(100MHZ, CDCl3)δ:36.9(C-1),28.8(C-2),75.2(C-3),38.0(C-4),139.4(C-5),122.7(C-6),3 2.0(C-7),31.3(C-8),49.9(C-9),36.7(C-10),20.8(C-11),39.8(C-12),40.2(C-13), 56.4(C-14),31.8(C-15),80.7(C-16),62.0(C-17),16.2(C-18),19.3(C-19),41.6(C -20),14.4(C-21),109.2(C-22),31.8(C-23),27.7(C-24),30.2(C-25),66.8(C-26),1 7.0(C-27),烟酸基团:123.4,126,137.1,150.7,153.0,164.5

  实施例143β-双水杨酸酯酰基薯蓣皂苷元

  称取diosgenin4.14g(10mmol),双水杨酸酯5.12g(20mmol),置于圆底 烧瓶中,溶于无水CH2Cl2,在冰浴冷却下,加入DCC 4.64g(20mmol), DMAP 20mg,室温下搅拌反应,TLC检测反应进程,反应约4小时,停止 反应。反应液过滤后拌样硅胶(80-100目)拌样,采用常压硅胶柱层析分 离。硅胶H(200-300目)用PE湿法装柱,以PE和PE-EtOAc=40∶1为流 动相,合并含有相同斑点的组分,减压蒸干,得到白色粉末,干燥后称重 为440mg。收率6.7%,编号Dio-3-27。

  ESI-MS:655[M+H]+

  NMR:1HNMR(400MHZ,CDCl3)δ:0.78(3H,s,H-18),0.99(3H,s, H-19),0.96(3H,d,J=7.2HZ,H-21),0.75(3H,d,J=6.8HZ,H-27),4.76(1 H,m,H-3),5.29(1H,d,J=4.8HZ,H-6),4.40(1H,q,H-16),3.4 7(1H,dd,J=10.4,3.2HZ,26-αH),3.37(1H,t,26-βH),双水杨酸基团: 0.84(1H,s,-OH),8.13(2H,q),7.64(1H,t,J=8HZ),7.54(1 H,t,J=7.2HZ),7.40(1H,t,J=7.6HZ),7.22(1H,d,J=7. 6HZ),7.04(1H,d,J=8.4HZ),7.00(1H,t,J=8HZ)

  实施例153β-(4’-乙酰水杨酰-阿魏酰基)-薯蓣皂苷元

  (1)阿司匹林酰香草醛酯的制备:称取阿司匹林5.4g(30mmol), 溶于30ml吡啶,0℃下滴加苯磺酰氯4ml(30mmol),30分钟后滴加香 兰素5g(33mmol,溶于15ml吡啶)。反应4小时后,将反应液倾入冰水 混合物中,搅拌均匀。冷藏过夜,过滤,得淡黄色固体,乙醇重结晶, 得白色粉末3.5g。

  (2)阿司匹林酰阿魏酸酯的制备:称取阿司匹林酰香草醛酯2.0g, 置于圆底烧瓶中,加入40ml无水乙醇,1.4g丙二酸,5滴苯胺,于70℃ 油浴加热,反应8小时。反应液减压浓缩,拌样硅胶(80-100目)拌样, 采用常压硅胶柱层析分离,得到白色粉末,干燥后称重为1.4g。

  (3)阿司匹林酰阿魏酸薯蓣皂苷元酯的制备:称取阿司匹林酰阿魏 酸酯1g,置于50ml茄形瓶中,加入无水CH2Cl2约5ml,滴加SOCl20.2 ml,吡啶2滴,在65℃下反应1.5小时。称取diosgenin 2.32g,溶于无水 CH2Cl2,在在冰浴冷却下,缓慢将其滴加到酰氯溶液中,室温下反应, TLC检测反应进程,停止反应后,反应液倒入适量水中,CH2Cl2萃取三 次,有机层合并,无水MgSO4脱水,过滤,滤液蒸干,常压硅胶柱分离, 得白色粉末300mg。编号Dio-3-34

  ESI-MS:754[M+H]+

  NMR:1HNMR(400MHZ,CDCl3)δ:0.80(3H,s,H-18),1.04(3 H,s,H-19),0.98(3H,d,J=7.2HZ,H-21),0.79(3H,d,J=6.8HZ,H- 27),4.75(1H,m,H-3),5.41(1H,d,J=4.8HZ,H-6),4.41(1H,q, H-16),3.47(1H,dd,J=10.4,3.2HZ,26-αH),3.38(1H,t,26-βH),阿司 匹林-阿魏酸基团:8.24(1H,dd,J=8,1.6HZ),7.64(1H,d,J=16 HZ),7.64(1H,s),7.39(1H,t,J=8HZ),7.15(4H,q),6.38(1 H,d,J=16HZ),3.84(3H,-OCH3),2.29(3H,-OAc);13CNMR(1 00MHZ,CDCl3)δ:13CNMR(100MHZ,CDCl3)δ:37.0(C-1),28.8(C-2),7 5.2(C-3),38.0(C-4),139.7(C-5),122.4(C-6),32.0(C-7),31.8(C-8),49.9(C-9),36. 7(C-10),20.8(C-11),39.8(C-12),40.2(C-13),56.4(C-14),31.9(C-15),80.8(C-1 6),62.0(C-17),16.3(C-18),19.3(C-19),41.6(C-20),14.5(C-21),109.2(C-22),31. 4(C-23),27.8(C-24),30.3(C-25),66.8(C-26),17.1(C-27);阿司匹林-阿魏酸基 团:55.9(-OCH3),20.9(-OAc),169.6,166.2,162.2,151.5,151.2,143.7,141. 2,134.6,133.7,132.4,126.1,124.0,123.4,122.3,121.2,118.9,111.3。

  甾体生物碱制成的药物 相关二:

  甾体皂甙类化合物及制备方法和含该化合物的药物组合物

  第一、技术领域:

  本发明属于甾体皂甙类化合物,还涉及该化合物的制备方法,以及该化合物为活性成分的药物组合物,以及它们在治疗浅表真菌和深部真菌感染中的应用。

  第二、背景技术:

  真菌感染是一种常见的多发病。由于近年来临床上广谱抗生素、化疗药物和免疫抑制剂大量应用,艾滋病患者、放射治疗的癌症患者以及器官移植病人的增加,使真菌感染尤其是深部真菌感染大幅上升。深部真菌感染主要是机遇型致病真菌引起的,主要是白色念珠菌(Candida albicans)、丝状真菌(filamentous fungus)、曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、隐球酵母菌(Cryptococcus)、镰刀霉菌(Fusarium)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、组织胞浆菌(Histoplasma).根霉菌(Rhizopus)等,其中白色念珠菌是最主要的机遇型致病真菌,有研究数据表明,约有一半的肿瘤患者感染上了白色念珠菌(Andriole VT.Current and future antifungaltherapy:new target for antifungal agents,J Antimicrob Chemther.1999,44:151-162)。另外白色念珠菌还可以引起阴道炎、龟头炎、鹅口疮、灼伤病人的炎症以及脑膜炎等疾病(GloriaMolero et al Candida albicans:genetics,dimorphism and pathogenicity.Internatl Microbio1.1998,1:95-106)。

  目前临床上常用的抗真菌药物有两大类:一类干扰真菌细胞膜脂质合成,如两性霉素B(Amphotericin B)、氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(ltraconazole)和特比萘酚(terbinafin);另一类干扰真菌核酸合成,如5-氟胞嘧啶(flucytosine)。然而,两性霉素B由于具有肾毒性而大大限制了其应用;氟康唑和伊曲康唑虽然毒性较小,但是它们易产生耐药性而使治疗指数大为降低;5-氟胞嘧啶也存在着抗菌谱窄,复发率高等问题;而特比萘酚对深部真菌感染无效。因此临床上迫切需要开发出高效、低毒、广谱的新型抗真菌药物(。目前普遍认为最有应用前景的抗真菌药物是未经修饰的天然产物及半合成的类似物。

  皂甙是一类极性较强的大分子化合物,不容易结晶,易溶于水和醇,难溶于有机溶剂。皂甙分甾体皂甙和三萜类皂甙两类。甾体皂甙(Steroidal saponins)是植物中一类重要的生物活性物质,它主要有两部分结构组成:即糖和甙元。甾体皂甙的甙元是含有27个碳原子的螺甾醇或呋甾醇。据不完全统计,已研究了近150种植物中的约200多种天然甾体皂甙,大多存在于单子叶植物的百合科、石蒜科和薯蓣科等植物中。常用中药知母、天门冬、麦门冬、七叶一枝花等都含有大量甾体皂甙。对于天然甾体皂甙的生物活性及其临床应用研究,最早如法国申请专利,报到了薯蓣皂甙元(diosgenin)及其甙具有抗关节炎作用。前苏联的科研人员发现高加索薯蓣中的皂甙提取物有降胆固醇的作用,临床实验也有证明。80年代Ravikumer等发现云南白药中的薯蓣皂甙有抗癌活性。从龙舌兰科的植物(Dracaenaafromontan)中分离出的新甾体皂甙(afromontoside)具有抑制KB细胞的活性。另外,美国Pfizer制药公司用替告皂甙元(tigogenin)和海柯皂甙元(Hecogenin)为甾体母核所合成的纤维双糖甙有很强的降血脂作用。我国也有很多有关甾体皂甙生物活性的报道。例如,从重楼属植物中分离出的甾体皂甙,具有止血、免疫调节、抗肿瘤及对心血管系统的作用。从叉蕊薯蓣(dioscorea colletti)中分离得到的叉蕊皂甙II有很明显的降胆固醇活性。从穿龙薯蓣(D.nipponica)中分得的薯蓣皂甙(dioscin)有明显的止咳、祛痰、平喘活性(丁怡,天然甾体皂甙的研究进展,中国新药杂志2000年第9卷第8期,p521-524)。

  甾体皂甙类化合物的抗真菌活性在国外已有研究报道,如美国专利6,310,091(DeLucca,II,et al October 30,2001)表明一种来源于胡椒中的新的甾体皂甙化合物CAY-1对植物、动物和人的不同种类的真菌感染尤其是对曲霉属真菌(Aspergillus spp.)、白色念珠菌(Candida albicans)、卡氏肺囊虫(Pneumocustis carinii)等具有良好的抗真菌活性,而且对哺乳动物细胞并无毒性。这种名为CAY-1甾体皂甙化合物的分子量(mol wt)是:1243.35Da,其分子结构是由一个半乳糖和四个葡萄糖所连接成的糖甙,再与甾醇连接而成,即这种甾体皂甙化合物CAY-I是由五个糖所组成。CAY-I对白色念珠菌ATCC90028的IC90是6.2microM,相当于7.7μg/ml,(De Lucca AJ,et al.Med Mycol.2002 Apr;40(2):131-7),不过白色念珠菌的菌液起始浓度比较低,只有104conida/ml,培养条件是在30℃培养7.5个小时(unitedstates patent 6,310,091,De Lucca,et al)。CAY-I的化学结构如下图所示:

  Fig.1 Structure of CAY-1.

  其杀菌机理是破坏真菌细胞壁(Renault S,et al.Med Mycol.2003 Feb;41(1):75-81)。还有报道从仙客来植物块茎所得的皂角苷(Calis,I.et al.,Planta Med.1997,63:166-170)可抑制多种念珠菌和隐球酵母菌的生长。(Favel,A.et al.,Planta Med.1994,60:50-53中的研究表明三萜类皂甙对多种病原真菌如脚癣菌、猩红发癣菌等具有广泛的抑菌活性。然而,并非所有的皂甙都具有抗真菌的活性,例如从葱球茎所得的八种皂甙只有四种能抑制链孢菌的生(Carotenuto,A.et al.,Phytochem.,1999,51:1077-1082),另一方面,目前也发现部分皂甙化合物对哺乳动物细胞的毒性较大,如Seo Y等从阿拉伯树胶分离鉴定出的六种皂甙化合物就有四种对哺乳动物具有很强的细胞毒性(Seo Y.et al.J Nat Prod.2002 Feb;65(2):170-4)。

  第三、发明内容:

  本发明的目的在于提供一类新的具有抗真菌活性的甾体皂甙类化合物,这种甾体皂甙类化合物具有高效低毒的广谱抗真菌作用,尤其适合于深部真菌感染的治疗。

  本发明的另一个目的是提供一种从叉蕊薯蓣中提取这类甾体皂甙类化合物的方法。

  本发明进一步提供一种治疗由白色念珠菌等引起的浅表真菌感染和深部真菌感染的药物组合物。

  本发明进一步提供上述化合物和组合物在制备浅表真菌感染和深部真菌感染的药物方面的用途。

  为了达到上述目的,对已分离鉴定好的三种甾体皂甙类化合物进行了抗真菌活性研究,发现了从叉蕊薯蓣中分离出的两种叉蕊皂甙化合物的抗真菌活性明显由优于CAY-I,从而完成了本发明,另一种从东一号剑麻汁发酵液分离出的甾体皂甙化合物因其抗真菌活性并不优于CAY-I,所以它仅作本发明的参考。

  本发明提供的药物组合物,甾体皂甙化合物作为有效成份,并含有常规药用载体在制备抗真菌药品中的应用。

  下列通式(I)

  其中R1由三糖所组成的直糖链或支链糖链,

  当

  时,这种甾体皂甙化合物名为Collettinside B,又称为叉蕊皂甙III。其具体的化学结构如下所示

  当

  时,这种甾体皂甙化合物名为CollettinsideA,又称为叉蕊皂甙IV。其具体的化学结构如下所示:

  为了完成本发明,本发明所采用的技术方案是:

  一本发明的两种叉蕊皂甙化合物按以下方法制备分离(薯蓣属植物化学成分的研究II.叉蕊薯蓣中甾体皂甙的分离和鉴定。刘承来等,药学学报18(8):597~606,1983.)。

  (1)叉蕊薯蓣根茎干粗粉60kg用75%的乙醇360L回流2h,过滤,提取液减压浓缩成稀浸膏,加水30L搅匀放置4h,离心,水液用正丁醇萃取二次(每次80L,放置3h),正丁醇液减压浓缩得总皂甙3kg,薄层(展开剂:氯仿-甲醇-水7∶3∶0.5)检查,可见13个斑点,其中4个含量较多。见图4。

  (2)取总皂甙100g用3kg硅胶干柱层析(柱床150×7cm,展开剂:氯仿-甲醇-水7∶3∶0.5,显色剂25%的磷钼酸乙醇溶液),展开后柱床切成25分,分别用热乙醇洗脱。薄层(展开剂:氯仿-甲醇-水7∶3∶0.5)检查6~13分为Collettinside B(又称叉蕊皂甙III)和Collettinside A(又称叉蕊皂甙IV)。

  (3)取Collettinside B(又称叉蕊皂甙III)和Collettinside A(又称叉蕊皂甙IV)混合皂甙4g,用200g硅胶干柱层析(展开剂:氯仿-甲醇-水7∶3∶0.3),展开后将柱床切成12分,热乙醇洗脱后薄层(展开剂:氯仿-甲醇-水7∶3∶0.5)检查,4~7分为CollettinsideA(又称叉蕊皂甙IV),9~11分为Collettinside B(又称叉蕊皂甙III),回收溶剂,95%乙醇重结晶后分别得Collettinside A 200mg,Collettinside B 300mg。薄层(展开剂:①氯仿-甲醇-水7∶3∶0.5,②氯仿-甲醇-水7∶3∶0.3,③二氯甲烷-甲醇9∶1)均为单一色点。

  二本发明的甾体皂甙类化合物的来源、理化常数和光谱数据

  叉蕊皂甙III:它的另一个分子名称(Mol Name)为Collettinside B.来源(Source):叉蕊薯蓣(Dioscorea collettii Hook.f.)的根茎,Appearance:白色粉末,化学分子式是C45H72O16,化学结构式为:3-O-{α-L-鼠李吡喃糖(1→4)-[α-L-鼠李吡喃糖(1→2)]-β-D-葡萄吡喃糖}-约莫皂甙元(3-O-{α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl(1→2)]-βL-D-glucopranosyl}-yamogenin),分子量(mol wt)是869.0660 Da,熔点Mp:290~292℃,[α]20D-121.3°(C=0.61,吡啶),红外光谱(KBr):Vmax=3400,1040,982,915>898,830cm-1;它的乙酸脂电子轰击质谱:m/z 792、519、413、396、282和273。(薯蓣属植物化学成分的研究II.叉蕊薯蓣中甾体皂甙的分离和鉴定。刘承来等,药学学报18(8):597~606,1983.)。

  叉蕊皂甙IV:它的另一个分子名称(Mol Name)为Collettinside A.也来源(Source)于叉蕊薯蓣根茎(Dioscorea collettii Hook.f.),Appearance:白色无定形固体(Amorphous solid),化学分子式是C45H72O17,化学结构式为:3-O-{β-D-葡萄吡喃糖(1→3)-[α-L-鼠李吡喃糖(1→2)]-β-D-葡萄吡喃糖}-约莫皂甙元(3-O-{β-D-glucopranosyl(1→3)-[α-L-rhamnopyranos yl(1→2)]-β-D-glucopranosyl}-yamogenin),分子量(mol wt)是885.0654 Da,熔点Mp:284~285℃,[α]20D-91.5°(C=0.40,吡啶),红外光谱(KBr):Vmax=3380,1040,980,910>890,830cm-1;它的乙酸脂电子轰击质谱:m/z 849、519、413、396、331、282和273。(薯蓣属植物化学成分的研究II.叉蕊薯蓣中甾体皂甙的分离和鉴定。刘承来等,药学学报18(8):597~606,1983.)。

  三东一号剑麻汁残渣发酵液中甾体皂甙的分离提取(Two new steroidal saponins from driedfermented residues of leaf-iuices of Agave sisalans forma Dong No.1,Ding Y.et al.ChemPharm Bull(Tokyo).1993 Mar;41(3):557-60.)。

  (1)干燥的东一号剑麻汁发酵残渣3Kg用汽油在60-80℃温度下回流后,再将不溶于汽油的残渣用甲醇萃取抽提,甲醇抽提物经减压蒸发得774g残渣。

  (2)再将残渣用100-200网眼得柱层析、氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)硅胶干柱层析,氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)薄层层析得到几个片断。

  (3)将高极性的片断重复以上步骤后,用甲醇结晶得五种甾体皂甙化合物:110mg皂甙化合物1(dongnoside E),1.25g皂甙化合物2(dongnoside D),186mg皂甙化合物3(dongnoside C),1.3g皂甙化合物4(dongnoside B),3.6g皂甙化合物5(dongnosideA)。

  四Dongnoside A的来源、理化常数和光谱数据

  Dongnoside A.来源(Source):东一号剑麻汁发酵液(Agave sisalana Dong No.1),Apperance:白色粉末(white powder),化学分子式是C62H102O31,化学结构式为:替告皂甙元-3-O-α-L-鼠李吡喃糖(1→4)-β-D-葡萄吡喃糖(1→2)-[β-D-木吡喃糖(1→3)-β-D-葡萄吡喃糖(1→3)]-β-D-葡萄吡喃糖(1→4)-β-D-半乳吡喃糖苷(tigogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→4)-β-D-glucopranosyl(1→2)-[β-D-xylopyranosyl(1→3)-β-D-glucopranosyl(1→3)]-β-D-glucopranosyl(1→4)-β-D-galacto pyranosid).分子量(mol wt)是1343.4856 Da,熔点Mp:265~270℃,[α]D-51.5°(C=0.07,吡啶),红外光谱(KBr):Vmax=3450-3470,1060-1080,985,920<900,865,815cm-1;negative FAB-MS:m/z 1341、1209、1195、1047、1033、901、739、577、413。(Two new steroidal saponins from dried fermented residues of leaf-juices of Agavesisalans forma Dong No.1,Ding Y,et al.Chem Pharm Bull(Tokyo).1993 Mar;41(3):557-60.)。其中Dongnoside A(又称剑麻皂甙A)化学结构为:

  五通过下面的试验说明本发明的甾体皂甙化合物的抗真菌活性。

  检测样品:将本发明的叉蕊皂甙III和叉蕊皂甙IV,以及DongnosideA三种甾体皂甙化合物溶解于二甲亚砜(DMSO),浓度为1mg/ml。再将三种甾体皂甙化合物用0.9%的生理盐水稀释至100μg/ml。

  试验真菌:

  白色念珠菌4-1和白色念珠菌62-1(由加拿大的Montreal university的G.Lemay教授惠赠)(啤酒酵母a161 I°II°,由武汉大学张翼老师提供。

  白色念珠菌4-1和白色念珠菌62-1是在YPD培养基(酵母粉1%,蛋白胨2%,葡萄糖2%)上培养,啤酒酵母a161 I°II°是在YPAD培养基(酵母粉1%,蛋白胨2%,葡萄糖2%,腺嘌呤0.004%)上培养,这三种菌株都在30℃培养。

  试验方法:

  从平板中挑取这三种菌株的单菌落,转到分别含有YPD和YPAD培养液的三角瓶中,在200r/min的摇床上于30℃过夜培养13个小时后,测三种菌株在OD580nm值,将三种菌液的起始OD580nm值用新鲜的相应培养液稀释。于96孔板中,加入以上100μg/ml的三种甾体皂甙类化合物各10μl,和稀释后的三种真菌菌液90μl,每个孔共加入100μl,使三种菌液在每个孔的起始OD580nm值均为0.1时(大约106cfu/ml),三种甾体皂甙类药物的最终浓度则是10μg/ml,并设不加药物的空白对照(即90μl菌液+10μl生理盐水)。于温度为30℃的培养箱中静止培养六个小时后,测它们的OD580nm值,通过以下公式计算其抑菌效率:

  其中B3表示空白(不加药物的菌液)在培养终点的OD580nm值,B1表示空白在培养起点的OD580nm值;而S3表示含10μg/ml药物的菌液在培养终点的OD580nm值,相应地,S1表示它在培养起点的OD580nm值。

  结果发现这三种甾体皂甙类化合物对三种真均有抑菌效果。

  表1:甾体皂甙类化合物在10μg/ml的浓度时,对三种真菌(起始菌液浓度的OD580nm值为0.1,大约106cfu/ml)的抑菌效率表。

  Dongnoside A的结构与CAY-I的化学结构很相近,区别在于Dongnoside A的替高皂甙元的2位碳原子上是两个氢原子,不同于CAY-I的甾体皂甙元的2位碳原子上含一个羟基和氢原子,Dongnoside A含六个糖连,CAY-I五个糖连,Dongnoside A的分子量为1343道尔顿,CAY-I的分子量为1243道尔顿。所以推测CAY-I的抑菌活性比Dongnoside A可能略强一些。所以Dongnoside A不纳入本发明的申请范围之内,仅作参考。

  本发明更进一步提供,这两个叉蕊皂甙类化合物(叉蕊皂甙III和叉蕊皂甙IV)具有毒副作用小的特点,尤其适合治疗由白色念珠菌引起的浅表真菌感染如鹅口疮、阴道炎、龟头炎、灼伤病人伤口感染等,和系统性深部真菌感染如艾滋病人、器官移植病人、化疗病人等的白色念珠菌感染。

  本发明与现有技术相比,具有以下特点:

  1这类叉蕊皂甙类化合物的分子量(分别为869道尔顿和885道尔顿)小于美国专利中的抗真菌甾体皂甙化合物CAY-I(它的分子量为1243道尔顿),因此更易于真菌感染病人的吸收。

  2最主要的是,这类叉蕊皂甙类化合物的抗真菌性能优于CAY-I。

  3这类叉蕊皂甙类化合物来源于在我国具有悠久入药历史的叉蕊薯蓣,因此也具有毒副作用小的特点,更适合于系统性深部真菌感染的治疗;CAY-I来源于胡椒。

  4本发明的叉蕊皂甙类化合物的化学结构与CAY存在一定的差异,无论是其皂甙元结构还是糖链结构。

  第四、附图说明

  图1表示Collettinside B(又称叉蕊皂甙III)在浓度分别为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml时,对白色念珠菌4-1、白色念珠菌62-1、啤酒酵母a161 I°II°的抑菌效率。

  图2表示Collettinside A(又称叉蕊皂甙IV)在浓度分别为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml时,对白色念珠菌4-1、白色念珠菌62-1、啤酒酵母a161 I°II°的抑菌效率。

  图3表示Dongnoside A在浓度分别为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml时,对白色念珠菌4-1、白色念珠菌62-1、啤酒酵母a161 I°II°的抑菌效率。

  在图1、图2、图3这三个图中,它们的纵坐标都表示甾体皂甙化合物对三种真菌的抑菌率(%),横坐标表示甾体皂甙化合物的药物的浓度梯度(μg/ml)。三种真菌的起始菌液浓度的OD580nm值为0.1,相当于106cfu/ml。培养条件都是在温度为30℃的培养箱中静止培养六个小时。从以上三个图中可以看出,在抗真菌效率方面:

  Collettinside B>Collettinside A>Dongnoside A

  图4表示叉蕊薯蓣中的总皂甙薄层层析图谱。其中I代表叉蕊皂甙I,II代表叉蕊皂甙,III代表叉蕊皂甙III,IV代表叉蕊皂甙IV.

  第五、具体实施方式

  1本发明的两种叉蕊皂甙(Collettinside B、Collettinside A)和CAY-I的比较

  抗白色念珠菌活性的比较:详细分析CAY-I和本发明的两种叉蕊皂甙(Collettinside B、Collettinside A)对白色念珠菌的抑菌活性,发现在30℃静止培养7.5个小时的培养条件下,CAY-I对白色念珠菌ATCC90028的IC90是6.2microM,相当于7.7μg/ml,不过白色念珠菌ATCC90028的菌液起始浓度比较低,只有104cfu/ml(De Lucca AJ,et al.Med Mycol.2002 Apr;40(2):131-7)。而在本发明的抑菌实验中,所采用的菌液起始浓度大约是它的100倍,即106cfu/ml,但两种叉蕊皂甙的抑菌效率依然很高。所以本发明的两种叉蕊皂甙的抗白色念珠菌活性明显优于CAY-I。

  结构比较:本发明的叉蕊皂甙类化合物的化学结构与CAY存在一定的差异,表现在:(一),叉蕊皂甙的甾环与CAY-I的甾环不同。Collettinside B和Collettinside A这两种叉蕊皂甙的皂甙元都是约莫皂甙元,其甾环的5位和6位C原子是C=C双键连接,而CAY-I甾环的5位和6位C原子是C-C单键连接;并且CAY-I甾环的2位C原子连有羟基,而叉蕊皂甙的甾环的2位C原子所连的不是羟基,而是两个氢原子;还有叉蕊皂甙的甾环的27位的-CH3的构象与CAY-I的甾环的27位的-CH3的构象不同。(二)两种叉蕊皂甙的糖甙与CAY-I的糖甙不同,本发明中两种叉蕊皂甙的糖甙是由三个单糖组成两种不同的糖链,而CAY-I是由五个糖组成的糖链。

  2 两种叉蕊皂甙化合物的毒副作用极小

  本发明的两种甾体皂甙化合物Collettinside B(叉蕊皂甙III)和Collettinside A(叉蕊皂甙IV)都来自在我国有悠久入药历史的中药叉蕊薯蓣。叉蕊薯蓣又称粉萆薢,始载于《神农本草经》,已被中国药典收入(《现代中药学大辞典》人民卫生出版社,下册)。从叉蕊薯蓣中所提的四种含约莫皂甙元的叉蕊皂甙化合物中,有药理实验已证明,这四种叉蕊皂甙化合物均有消炎和降血糖活性(李雪征,萆薢的研究进展,中国野生植物资源,2001年第21卷第5期),并报道叉蕊皂甙II具有明显的降胆固醇活性(丁怡,天然甾体皂甙的研究进展,中国新药杂志2000年第9卷第8期,p521-524),(中国专利,1243129A)也表明其毒副作用都极小。而本发明发现叉蕊皂甙III和叉蕊皂甙IV具有明显的抗真菌活性,而且叉蕊皂甙III的抗真菌活性优于叉蕊皂甙IV。即发现这两种叉蕊皂甙化合物的抗真菌新用途。因此,本发明中的甾体皂甙类化合物除了可以治疗由白色念珠菌引起的表面真菌感染之外,尤其适用于由白色念珠菌引起的深部真菌感染(血液循环中的白色念珠菌感染)的治疗,比如艾滋病人、器官移植病人、灼伤病人、化疗病人以及进行大量外科手术病人的白色念珠菌感染等。

  3 两种叉蕊皂甙和Dongnoside A的广谱抗真菌实验

  从平板中挑取白色念珠菌4-1、白色念珠菌62-1、啤酒酵母a161 I°II°这三种菌株的单菌落,分别于YPD和YPAD培养液中在200r/min的摇床上于30℃过夜培养13个小时后,测三种菌株在OD580nm值,将三种菌液的起始OD580nm值用新鲜的相应培养液稀释,用移液枪转移至96孔板中,并加入不同药物浓度的叉蕊皂甙III和IV以及Dongnoside A,使三种菌液的起始浓度的OD580nm值都为0.1(大约106cfu/ml),并设不加药物的空白对照,在温度为30℃的培养箱中静止培养六个小时后,测它们的OD580nm值,通过以下公式计算其抑菌效率:

  其中B3表示空白(不加药物的菌液)在培养终点的OD580nm值,B1表示空白在培养起点的OD580nm值;而S3表示含药物的菌液在培养终点的OD580nm值,相应地,S1表示它在培养起点的OD580nm值。将实验结果记录并作两种叉蕊皂甙以及Dongnoside A的量效曲线图。结果见说明书附图。发现Collettinside B和Collettinside A对三种真菌都呈现很强的抗真菌活性,而Dongnoside A的抗真菌活性一般,仅作本发明的参考。

  由于白色念珠菌可以在浅表引起鹅口疮、阴道炎、龟头炎等,在深部可以引起脑膜炎、循环中的血液真菌感染,如艾滋病人、器官移植病人、灼伤病人、化疗病人以及进行大量外科手术病人的白色念珠菌感染等,所以本发明为这些真菌感染性疾病提供了一类新的治疗药物。

  4本发明中的甾体皂甙类化合物作为抗真菌剂的应用形式

  由本发明的甾体皂甙类化合物作为抗真菌药物时,通常以与制药载体(例如填料、疏松填料、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂或赋性剂)配制。药物制剂可以根据感染部位和治疗目的从各种给药剂型中选择,一般的给药剂型包括:片剂、软膏剂、丸剂、栓剂、粉剂、胶囊、颗粒剂、粉末制剂、注射用制剂(例如溶液剂、乳剂、悬浮剂等)。

  将给药单元剂型制成片剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体,如结晶纤维素、乳糖、羟丙基纤维素、硬脂酸镁、高岭土、碳酸钙、淀粉等;粘合剂如水、淀粉溶液、羧甲基纤维素等;崩解剂如干燥淀粉、藻酸钠、琼脂粉、单硬脂酸甘油脂等;湿润剂如甘油、淀粉等;吸附剂如淀粉、乳糖等;润滑剂如聚乙二醇、滑石等;片剂可根据需要制成糖胞衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片。

  实施例1:甾体皂甙类化合物50mg,结晶性纤维素50mg,乳糖50mg,羟丙基纤维素18mg,硬脂酸镁2mg共170mg按照本领域已知的方法配制成片剂。

  将给药单元剂型制成软膏剂,可以选用由水、脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蜡、石蜡、液体石蜡、树脂、高级醇、塑料、表面活性剂组成的疏水性基质或亲水性基质等在内的添加剂。

  将给药单元剂型制成丸剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体,如作为赋性剂的乳糖、可可脂、高岭土、滑石等,作为粘合剂的粉末状阿拉伯胶、明胶、乙醇等,作为崩解剂的褐藻淀粉、琼脂等。

  实施例2:甾体皂甙类化合物50mg,淀粉100mg,蔗糖100mg,滑石100mg,净化水,聚乙二醇,乙醇,羟丙基纤维素50mg按照本领域已知的方法配制成丸剂。

  将给药单元剂型制成栓剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体,如聚乙二醇、可可脂、高级醇、明胶、半合成甘油酯等。

  实施例3:甾体皂甙类化合物50mg,淀粉50mg,硬脂酸镁8mg,碳酸氢钠20mg,适量约6%乙醇做湿润剂,压入模内制成栓剂。

  将给药单元剂型制成胶囊,可以广泛使用本领域公知的各种载体,如乳糖、淀粉、滑石、沉淀的硅酸酐等。

  实施例4:甾体皂甙类化合物50mg,沉淀的硅酸酐25mg,乳糖100mg,淀粉50mg,滑石25mg共250mg按照本领域已知的方法配制成胶囊制剂。

  将给药单元剂型制成颗粒制剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体,如乳糖、玉米淀粉、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素等。

  实施例5:甾体皂甙类化合物50mg,乳糖600mg,玉米淀粉200mg,羧甲基纤维素钠20mg,羟丙基纤维130mg共1000mg按照本领域已知的方法配制成颗粒制剂。

  将给药单元剂型制成粉末制剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体,如乳糖、淀粉、沉淀的硅酸酐、沉淀的碳酸钙等。

  实施例6:甾体皂甙类化合物50mg,沉淀的硅酸酐20mg,沉淀的碳酸钙10mg,乳糖250mg,淀粉70mg共400mg按照本领域已知的方法配制成粉末制剂

  将给药单元剂型制成注射制剂,可以广泛使用本领域常用的所有稀释剂,如水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇等,须先将溶液剂、乳剂和悬浮剂灭菌,而且这些制剂最好制备成是与血液等渗的,可以向注射用制剂中添加适量氯化钠、葡萄糖或甘油,此外,还可以添加常规的溶解添加剂、缓冲剂、局部麻醉剂等。

  实施例7:甾体皂甙类化合物20mg,,丙二醇60mg,葡萄糖50mg,注射用蒸馏水和生理盐水至1ml按照本领域已知的方法配制成注射制剂。

  本发明作为抗真菌制剂时给药方法没有限制,可以根据具体的剂型、病人的年龄、性别和身体状况的差异、真菌感染的部位及严重程度等进行分类给药。例如,鹅口疮可以采用喷雾剂或口服给药,浅表白色念珠菌感染如阴道炎可采用栓剂、软膏剂给药,龟头炎等可采用软膏剂、酊剂,而深部真菌感染可以采取片剂、丸剂、颗粒剂和胶囊等进行口服给药,或者用注射用制剂可以单独(或与常规的输液用溶液如葡萄糖、氨基酸、氯化钠、甘油等混合)进行静脉血管内给药,也可以采取肌肉内、皮下、皮内、腹膜内给药。

  甾体生物碱制成的药物 相关三:

  介芬胺类甾体生物碱衍生物及其制备与应用

  第一、技术领域

  本发明涉及药物,具体涉及新型介芬胺类甾体生物碱衍生物及其制备与它们在制备抗肿瘤药物的应用。

  第二、背景技术

  藜芦属(Veratrum)为百合科(Liliaceae)植物,世界上约有40种。中医用藜芦(V.nigrum L.)、兴安藜芦(V.dahuricum(Turcz.)Loes.f.)、天目藜芦(V.SchindleriLoes.f.)、毛穗藜芦(V.maackii Regel)、大理藜芦(V..taliense Loes.f.)、毛叶藜芦(V.grandiflorum(Maxim.)Loes.f.)等的根和根茎入药,用于中风痰壅,癫痫、喉痹不通,及疥癣和恶疮(中华本草(八).上海科学技术出版社,1999,183-188)。现代药理学研究表明,藜芦生物碱具有降血压和抗肿瘤作用(中药辞海(第四卷).中国医药科技出版社,1998,8-13;徐国钧,徐珞珊,王峥涛,等.常用中药材品种整理和质量研究(第四册).福建:福建科学技术出版社,2001,121-178)。甾体生物碱环杷明最初从毛叶藜芦(Veratrum grandiflorum)中分离并鉴定,最新研究表明它是一种Hedgehog通路抑制剂,对多种肿瘤有良好的抑制作用(Hammerschmidt,M.,et al.,Trends Genet.1997,13(1):14-21)。环杷明作为一种潜在的抗肿瘤新药在世界范围内掀起了研究热潮。从藜芦中分离得到的另一种甾体生物碱-藜芦胺具有显著的抗肿瘤活性,但该化合物的毒性较大,小鼠静脉和皮下给药,其LD50分别为3.1mg/kg和4.5mg/kg(Kiyoshi Tanaka,J.Pharma.Exp.Therapeutics.1955,113(1):89-99)。介芬胺自身的抗肿瘤活性不及环杷明和藜芦胺显著,但其结构与环杷明和藜芦胺相近,经还原可以得到环杷明(Masamune,T,et al.,Bull.Chem.Soc.Jap.,1965,38(8):1374-1378)。

  藜芦胺 介芬胺 环杷明

  因此,对上述三种生物碱进行结构修饰与改造,期望从中发现新的具有良好抗肿瘤活性的化合物。

  第三、发明内容

  本发明所要解决的技术问题在于,以藜芦中分离得到的甾体生物碱藜芦胺、介芬胺及环杷明为原料制备其衍生物,并研究这些衍生物在抗肿瘤方面的应用。

  本发明提供了一种介芬胺类甾体生物碱衍生物A,包括化合物:Δ4-藜芦胺-3-肟1,Δ4-介芬胺-3-肟2,Δ4-环杷明-3-肟3,Δ4-藜芦胺-3-(4-硝基)苯腙4,Δ4-介芬胺-3-(4-硝基)苯腙5,3-甲基-N-甲基藜芦胺6,3,23-二甲基-N-甲基藜芦胺7,3-甲基-N-甲基介芬胺8,3-甲基-N-甲基环杷明9,3α-氯-藜芦胺10,3α-氯-介芬胺11,3α-氯-环杷明12,N-棕榈酰基藜芦胺13,N-棕榈酰基介芬胺14,N-棕榈酰基环杷明15,N-棕榈酰基-3-羰基-Δ4-藜芦胺16,N-棕榈酰基-3-羰基-Δ4-环杷明17,N-氯代乙酰基藜芦胺18,N-(N-乙基哌嗪)乙酰基藜芦胺19,N-(N-(2-吡啶)哌嗪)乙酰基藜芦胺20,N-(N-(2-吡嗪基)哌嗪)乙酰基藜芦胺21,N-(N-(2-胡椒基)哌嗪)乙酰基藜芦胺22,N-氯代乙酰基介芬胺23,N-(N-乙基哌嗪)乙酰基介芬胺24,N-(N-(2-吡啶)哌嗪)乙酰基介芬胺25,N-(N-(2-吡嗪基)哌嗪)乙酰基介芬胺26,N-(N-(2-胡椒基)哌嗪)乙酰基介芬胺27,N-氯代乙酰基环杷明28,N-(N-乙基哌嗪)乙酰基环杷明29,N-(N-(2-吡啶)哌嗪)乙酰基环杷明30,N-(N-(2-吡嗪基)哌嗪)乙酰基环杷明31,N-(N-(2-胡椒基)哌嗪)乙酰基环杷明32,N-(N-环己基哌嗪)乙酰基环杷明33,N-(环丙胺)乙酰基环杷明34,N-氯代乙酰基-3-羰基-Δ4-藜芦胺35,N-(N-乙基哌嗪)乙酰基-3-羰基-Δ4-藜芦胺36,N-(N-(2-吡啶)哌嗪)乙酰基-3-羰基-Δ4-藜芦胺37,N-(N-(2-吡嗪基)哌嗪)乙酰基-3-羰基-Δ4-藜芦胺38,N-(N-(2-胡椒基)哌嗪)乙酰基-3-羰基-Δ4-藜芦胺39,N-(环丙胺)乙酰基-3-羰基-Δ4-藜芦胺40,N-二氯代乙酰基藜芦胺41,N-二氯代乙酰基介芬胺42,N-二氯代乙酰基环杷明43,N-二氯代乙酰基-3-羰基-Δ4-藜芦胺44,N-二(二氯代)乙酰基-3-羰基-Δ4-环杷明45,N-2′,4′-二氟苯甲酰基环杷明46,2′,4′-二氟苯甲酰基-3-羰基-Δ4-环杷明47,N-溴代乙基藜芦胺48,N-(N-乙基哌嗪)乙基藜芦胺49,N-(环丙胺)乙基藜芦胺50,N-氯代乙基介芬胺51,N-溴代乙基介芬胺52,N-(N-乙基哌嗪)乙基介芬胺53,N-(N-(2-吡啶)哌嗪)乙基介芬胺54,N-(N-(2-吡嗪基)哌嗪)乙基藜芦胺55,N-(N-(2-胡椒基)哌嗪)乙基介芬胺56,N-(N-环己基哌嗪)乙基介芬胺57,N-(环丙胺)乙基介芬胺58,N-氯代乙基-3-羰基-Δ4-藜芦胺59,N-溴代乙基-3-羰基-Δ4-藜芦胺60,N-溴代乙基环杷明61,N-(N-乙基哌嗪)乙基环杷明62,N-(N-(2-吡啶)哌嗪)乙基环杷明63,N-(N-(2-吡嗪)哌嗪)乙基环杷明64,N-(N-(2-胡椒基)哌嗪)乙基环杷明65,N-(环丙胺)乙基环杷明66,N-氯代乙基-3-羰基-Δ4-环杷明67,N-溴代乙基-3-羰基-Δ4-环杷明68,碘化N,N-二甲基介芬铵69,碘化N,N-二甲基环杷明铵70,N-甲基-3-羰基-Δ4-藜芦胺71,碘化N,N-二甲基-3-羰基-Δ4-藜芦铵72,N-乙基介芬胺73,N-辛基介芬胺74,N-乙基环杷明75,N-辛基环杷明76,N-二甲胺基乙基介芬胺77,N-二甲胺基乙基环杷明78,N-二甲胺基乙基-3-羰基-Δ4-环杷明79,N-(4-硝基苄基)介芬胺80,N-(4-硝基苄基)环杷明81,N-(4-硝基苄基)-3-羰基-Δ4-环杷明82,N-(4-氟苄基)介芬胺83,N-(4-氟苄基)环杷明84,N-(4-氟苄基)-3-羰基-Δ4-环杷明85,N-OH藜芦胺86,N-OH介芬胺87,N-OH环杷明88,N-OH-3-羰基-Δ4-藜芦胺89,N-OH-3-羰基-Δ4-介芬胺90,N-OH-3-羰基-Δ4-环杷明91,5,6-二溴藜芦胺92,5,6-二溴介芬胺93。共93个衍生物,所述衍生物包括N-烃化物、N-酰化物等。

  本发明所述介芬胺类甾体生物碱衍生物的基本结构如下式A:

  本发明所述93个化合物的结构式如下:

  本发明的另一目的是提供了上述介芬胺类甾体生物碱衍生物的制备方法,该方法包括下列步骤:

  (1)分别以甾体生物碱藜芦胺、介芬胺及环杷明为原料,经Oppennauer氧化反应制备化合物:3-羰基-Δ4-藜芦胺,3-羰基-Δ4-介芬胺,3-羰基-Δ4-环杷明;所述

  反应中使用异丙醇铝/环己酮,或异丙醇铝/丁酮,或异丙醇铝/丁酮与环己酮氧化体系。异丙醇铝/环己酮氧化体系中环己酮用量与原料的摩尔比为5-12,优选8-10;丙醇铝/丁酮氧化体系中丁酮的用量与原料的摩尔比为10-20,优选12-15;两种氧化体系中异丙醇铝与原料的摩尔比均为1-8,优选2;溶剂选用甲苯或苯,每g原料需要溶剂15-30mL,优选18-20mL,反应须在无水反应体系中进行;反应温度为90-130℃,优选110±5℃;反应时间为2-5h,优选3-4h;反应结束蒸除甲苯,剩余的环己酮和产生的环己醇,直接加入石油醚静置析出淡黄色块状结晶除去,或将蒸除溶剂得到的黄色液体直接经短硅胶柱纯化剩余的环己酮和产生的环己醇,得到白色的粉末或针晶,分别制得化合物3-羰基-Δ4-藜芦胺,3-羰基-Δ4-介芬胺,3-羰基-Δ4-环杷明。

  (2)分别取步骤(1)3-羰基-Δ4-藜芦胺,3-羰基-Δ4-介芬胺和3-羰基-Δ4-环杷明经与盐酸羟胺或对硝基苯肼缩合,制备化合物1,2,3,4,5;所述反应中采用甲醇或乙醇为溶剂,盐酸羟胺与原料的摩尔比为1.5-10,优选3-5;反应温度为10-85℃,优选60-85℃;反应时间为2-8h,优选3-4h;

  (3)分别取步骤(1)藜芦胺,介芬胺,环杷明采用硫酸二甲酯进行甲基化反应,制备化合物6,7,8,9;所述反应中采用K2CO3或Na2CO3为缚酸剂、丙酮、THF或二氧六环为溶剂;硫酸二甲酯与原料的摩尔比为1.2-5,优选1.2-2;反应温度为10-60℃,优选15-45℃;反应时间为4-16h,优选8-12h;反应结束后萃取用的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯的一种或多种;

  (4)分别取步骤(1)藜芦胺,介芬胺,环杷明采用SOCl2进行氯代反应,制备化合物10,11,12;所述反应体系采用吡啶为溶剂,得到一构型翻转为主的产物;滴加SOCl2的反应温度为0-5℃,滴加完毕反应温度15-35℃;反应时间为4-16h,优选8-12h;反应结束后萃取用的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯的一种或多种;

  (5)分别取步骤(1)藜芦胺,介芬胺,环杷明,3-羰基-Δ4-藜芦胺,3-羰基-Δ4-介芬胺和3-羰基-Δ4-环杷明经N酰化制备化合物:13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47;所述反应中以CH3(CH2)14COCl,ClCH2COCl和Cl2CHCOCl为酰化剂,酰化剂与原料的摩尔比为1∶5-20,优选1∶8-10;溶剂选用CH2Cl2、CHCl3、CCl4或(CH2)2Cl2中的一种或几种,每g原料用溶剂100-300mL,优选150-200mL;反应温度为-5-40℃,优选以冰浴条件下滴加酰化剂,再在10-15℃下反应;反应时间为4-20h,优选8-14h;当原料结构中存在3-OH(如:藜芦胺,介芬胺,环杷明),反应结束后加入过量甲醇和3-8倍摩尔量的金属钠在45℃左右搅拌1h,或直接加入过量甲醇反应回流0.5h,醇解生成的酯;(由于以ClCH2COCl和Cl2CHCOCl为酰化剂与生物碱反应时,如果生物碱存在3-OH时,则会生成3-OH的酯:ClCH2COOR和Cl2CHCOOR,该类酯化合物不稳定,加入甲醇回流即可醇解得到3-OH。在Na/CH3OH条件下也可得到3-OH产物)。

  (6)分别取步骤(1)藜芦胺,介芬胺,环杷明,3-羰基-Δ4-藜芦胺,3-羰基-Δ4-介芬胺和3-羰基-Δ4-环杷明经N烃化制备化合物:48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85;所述反应中卤代烷为1,2-二氯乙烷或1,2-二溴乙烷,卤代烷与原料的摩尔比为1.2-20,优选2-5;反应体系以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂,每g原料用DMF5-15mL,或直接以过量的卤代烷为溶剂;缚酸剂选用K2CO3、Na2CO3、NaHCO3、NaOH或KOH中的一种或几种;反应温度为0-50℃,优选室温;反应时间为12-48h,优选32-40h;反应结束后萃取用的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯的一种或多种;

  (7)分别取步骤(1)藜芦胺,介芬胺,环杷明,3-羰基-Δ4-藜芦胺,3-羰基-Δ4-介芬胺和3-羰基-Δ4-环杷明经N羟基化制备化合物:86,87,88,89,90,91;采用过氧苯甲酸或间氯过氧苯甲酸为氧化剂氧化剂与原料的摩尔比为1.2-3,优选1.2-1.5;加入氧化剂过程的反应温度为冰浴,加毕后反应温度为5-20℃,优选10-15℃;以二氯甲烷、氯仿、四氯化碳或丙酮为溶剂,优选二氯甲烷、氯仿;反应结束后萃取用的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯的一种或多种。

  (8)分别取步骤(1)藜芦胺与Br2发生亲电加成,制备化合物92,93;所述反应中以醋酸为溶剂,用量为4-20mg/mL,藜芦胺与Br2原料的摩尔比为5-50,优选20-30;加毕后反应温度为5-50℃,优选10-25℃;反应时间12-48h,优选18-24h;反应结束后萃取用的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯的一种或多种。

  本发明的又一目的是提供了上述介芬胺类甾体生物碱衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

  本发明选用人胰腺癌细胞BxPC-3和SW1990,小细胞肺癌细胞NCI-H466和非小细胞肺癌细胞NCI-H157等细胞系,采用MTT法评价所有化合物的抗肿瘤活性,。结果显示衍生物41,43,58具有显著的抗肿瘤活性,其他8个衍生物:10,18,1938,45,48,50,92也表现出中等的抗肿瘤活性。

  第四、具体实施方式

  通过以下实施例对本发明进一步说明。

  实施例1:

  将25mg(0.06mmol)3-羰基-Δ4-藜芦胺溶于15mL甲醇中,加入盐酸羟胺18mg(0.25mmol)。回流反应4h。反应结束后浓缩至2mL,静置于冰箱内,析出白色结晶111mg,收率42.4%。

  化合物1:

  白色粉末,ESI-MS:m/z 423.3[M+H]+,1H-NMR(400MHz,CD3OD,J/Hz)δ:7.11(d,1H,J=13,H-16),6.97(d,1H,J=13,H-15),5.85(s,1H,H-4),3.53(m,1H,H-20),3.16(m,1H,H-23),3.05(t,1H,J=7,H-6a),2.98(t,1H,H-8),2.85(dd,1H,J=4,H-26a),2.77(dd,1H,H-11),2.48(m,1H,H-23),2.31(s,3H,H-18),2.08(t,1H,J=4,H-26b),2.00(brs,1H,H-24a),1.50(d,3H,H-21),1.18(s,3H,H-19),1.05(dd,1H,H-24b)0.83(d,3H,H-27);13C-NMR(400MHz,CD3OD)δ:157.5(C-5),154.9(C-3),144.7(C-12),143.7(C-14),141.2(C-17),133.9(C-13),126.5(C-16),120.5(C-15),119.7(C-4),71.7(C-23),67.9(C-22),61.5(C-9),54.5(C-26),45.3(C-8),44.9(C-24),39.1(C-10),37.3(C-20),36.3(C-7),33.8(C-6),32.4(C-25),31.3(C-1),31.3(C-11),21.3(C-21),19.6(C-2),19.2(C-27),17.6(C-19),16.0(C-18).

  经类似操作,分别以3-羰基-Δ4-介芬胺和3-羰基-Δ4-环杷明为原料与与盐酸羟胺反应,得到2,3,以3-羰基-Δ4-藜芦胺,3-羰基-Δ4-介芬胺为原料与对硝基苯肼反应得到4,5。

  化合物2:白色粉末,ESI-MS:m/z 439.6[M+H]+;

  化合物3:白色粉末,ESI-MS:m/z 425.6[M+H]+;

  化合物4:白色粉末,ESI-MS:m/z 543.7[M+H]+;

  化合物5:白色粉末,ESI-MS:m/z 559.7[M+H]+;

  实施例2:

  将100mg(0.24mmol)藜芦胺溶于10mL丙酮中,加入0.3gK2CO3(2.4mmol)和硫酸二甲酯(DMS)0.5mL(5.2mmol),于25℃反应过夜。蒸除溶剂后加入水30mL,用乙酸乙酯3×30mL萃取,有机层用30mL的饱和食盐水洗涤,用无水Na2SO4干燥。蒸除溶剂得粗产物102mg,经硅胶柱分离得到化合物6(31mg)、7(8mg)。

  化合物6:白色粉末,ESI-MS:m/z 438.3[M+H]+;

  化合物7:白色粉末,ESI-MS:m/z 452.4[M+H]+;

  相同的实验操作,只是将反应物分别改为介芬胺和环杷明,相应的得到8,9。

  化合物8:白色粉末,ESI-MS:m/z 454.3[M+H]+;

  化合物9:白色粉末,ESI-MS:m/z 440.4[M+H]+;

  实施例3:

  将41mg(0.1mmol)藜芦胺溶于8mL吡啶中,冰水冷却后滴加SOCl20.2mL(2.8mmol),逐渐升温至25℃,反应过夜。TLC表明反应结束,加入50mL乙酸乙酯,用3×30mL的水洗涤,有机层用30mL的饱和食盐水洗涤,用无水Na2SO4干燥。蒸除溶剂得粗产物40mg,经硅胶柱分离得到化合物10(20mg)。

  相同的实验操作,只是将反应物分别改为介芬胺和环杷明,相应的得到11、12。

  化合物10:白色粉末,ESI-MS:m/z 428.3[M+H]+;

  化合物11:白色粉末,ESI-MS:m/z 444.3[M+H]+;

  化合物12:白色粉末,ESI-MS:m/z 430.4[M+H]+;

  实施例4:

  将0.82g(2.0mmol)藜芦胺溶于50mL CH2Cl2中,冰水冷却后滴加氯乙酰氯(CH2ClCOCl)4mL(50mmol),逐渐升温至25℃,反应4h,TLC表明反应结束,加入10mL甲醇继续反应0.5h,蒸除溶剂,加入200mL乙酸乙酯,用3×80mL的水洗涤,有机层用80mL的饱和食盐水洗涤,用无水Na2SO4干燥。蒸除溶剂得粗产物0.76g,经硅胶柱分离得到化合物18(0.65g),收率66.8%。

  化合物18:

  白色粉末,ESI-MS:m/z 486[M+H]+,1H-NMR(600MHz,CDCl3,J/Hz)δ:6.93(d,1H,J=7.8,H-16),6.84(d,1H,J=7.2,H-15),5.39(d,1H,J=4.8,H-6),3.83(m,1H,H-20),3.53(brs,3H,COCH2Cl),3.44(m,1H,H-3),3.25(m,1H,H-23),2.85(m,1H,H-26b),2.82(m,1H,H-8),2.70(m,1H,H-11b),2.67(m,1H,H-1b),2.50(m,1H,H-2b),2.50(m,1H,H-22),2.21(brs,3H,H-18),1.10(d,3H,J=7.2,H-21),1.06(brs,3H,H-19),1.03(d,3H,J=6.6,H-27);13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:167.4(COCH2Cl),143.9(C-14),142.5(C-5),142.3(C-17),138.5(C-12),131.4(C-13),124.8(C-16),121.7(C-6),120.0(C-15),71.2(C-3),67.2(C-23),60.4(C-22),56.9(C-9),47.1(C-26),43.2(C-4),41.3(C-24),41.0(C-8),40.9(COCH2Cl),37.8(C-1),36.7(C-10),34.2(C-20),30.7(C-7),30.2(C-11),30.1(C-2),27.2(C-25),20.8(C-27),20.2(C-21),19.0(C-19),15.1(C-18).

  相同的实验操作,以介芬胺、环杷明和3-羰基-Δ4-藜芦胺味原料与氯乙酰氯反应,制备化合物23,28,35。以藜芦胺、介芬胺、环杷明、3-羰基-Δ4-藜芦胺及3-羰基-Δ4-环杷明与二氯乙酰氯反应制备化合物41,42,43,44,45。

  化合物23:白色粉末,ESI-MS:m/z 502.3[M+H]+;

  化合物35:白色粉末,ESI-MS:m/z 484.2[M+H]+;

  化合物42:白色粉末,ESI-MS:m/z 536.2[M+H]+;

  化合物44:白色粉末,ESI-MS:m/z 518.2[M+H]+;

  化合物45:白色粉末,ESI-MS:m/z 520.1[M+H]+;

  化合物28:

  白色粉末,ESI-MS:m/z 488[M+H]+,1H-NMR(600MHz,CDCl3,J/Hz)δ:5.35(d,1H,J=1.8,H-6),3.78(s,2H,COCH2Cl),3.48(m,1H,H-3),3.28(m,1H,H-23),3.15(m,1H,H-26b),2.74(dd,1H,J=19.2,3.6,H-22),2.28(m,1H,H-20),1.59(brs,3H,H-18),1.23(d,3H,J=7.2,H-21),1.13(brs,3H,H-19),1.08(d,1H,J=6.6,H-27);13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:166.8(COCH2Cl),144.2(C-5),137.8(C-13),125.2(C-12),119.1(C-6),87.0(C-17),75.7(C-23),71.8(C-3),56.3(C-22),51.6(C-9),46.3(C-26),43.2(C-14),42.0(C-8),41.9(C-20),41.2(C-4),40.8(COCH2Cl),37.7(C-24),35.0(C-10),33.4(C-1),33.1(C-2),30.3(C-11),29.6(C-7),27.0(C-25),26.5(C-16),24.4(C-15),19.6(C-19),19.1(C-27),15.3(C-18),13.1(C-21).

  化合物41:

  白色粉末,ESI-MS:m/z 520[M+H]+,542[M+Na]+,1H-NMR(600MHz,CDCl3,J/Hz)δ:6.85(d,1H,J=7.2,H-16),6.76(d,1H,J=7.2,H-15),6.02(brs,1H,COCHCl2),5.32(brs,1H,H-6),3.94(m,1H,H-20),3.48(m,1H,H-3),3.37(m,1H,H-23),3.05(m,1H,H-26b),2.60(m,1H,H-22),2.14(brs,3H,H-18),1.02(d,3H,J=7.2,H-21),0.98(brs,3H,H-19),0.93(d,3H,J=6.6,H-27);13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:165.1(COCHCl2),144.4(C-14),142.9(C-5),142.8(C-17),138.5(C-12),131.5(C-13),122.1(C-16),121.4(C-6),120.6(C-15),71.6(C-3),67.7(C-23),64.6(C-22),63.9(COCHCl2),57.2(C-9),47.7(C-26),44.3(C-4),41.7(C-24),41.4(C-8),38.3(C-1),37.1(C-10),34.9(C-20),31.0(C-7),30.6(C-11),30.4(C-2),27.5(C-25),20.8(C-27),20.4(C-21),19.4(C-19),15.6(C-18).

  化合物43:

  白色粉末,ESI-MS:m/z 522.3[M+H]+,1H-NMR(600MHz,CDCl3,J/Hz)δ:6.11(s,1H,N-CHCl2),5.93(s,1H,O-CHCl2),5.55(d,1H,J=5.4,H-6),4.79(m,1H,H-3),4.22(m,1H,H-23),3.17(m,1H,H-26b),2.46(m,1H,H-22),2.13(m,1H,H-20),1.60(brs,3H,H-18),1.33(d,3H,J=7.2,H-21),1.20(d,1H,J=6.6,H-27),1.18(brs,3H,H-19);13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:164.4(O-COCHCl2),163.9(N-COCHCl2),140.4(C-5),138.3(C-13),123.6(C-12),120.6(C-6),85.0(C-17),76.9(C-23),76.8(C-3),67.4(C-22),64.64(O-COCHCl2),64.56(N-COCHCl2),56.8(C-9),49.6(C-14),47.4(C-26),41.1(C-8),37.5(C-4),37.4(C-20),37.1(C-24),36.9(C-10),34.7(C-1),32.9(C-2),30.2(C-11),29.7(C-7),27.3(C-25),27.0(C-16),22.7(C-15),20.8(C-19),19.1(C-27),15.5(C-18),14.1(C-21).

  实施例5:

  将48.5mg(0.1mmol)18溶于10mLDMF中,加入乙基哌嗪0.5mL(40mmol),逐渐升温至45℃,反应过夜,反应结束后加入80mL乙酸乙酯,用3×40mL的水洗涤,有机层用40mL的饱和食盐水洗涤,用无水Na2SO4干燥。蒸除溶剂得粗产物45mg,经硅胶柱分离得到化合物19(34mg),收率60.0%。

  相同的实验操作,化合物18与N-(2-吡啶)哌嗪,N-(2-吡嗪基)哌嗪,N-(2-胡椒基)哌嗪反应,制备化合物20~22;化合物23与乙基哌嗪,N-(2-吡啶)哌嗪,N-(2-吡嗪基)哌嗪,N-(2-胡椒基)哌嗪反应得24~27;化合物28与乙基哌嗪,N-(2-吡啶)哌嗪,N-(2-吡嗪基)哌嗪,N-(2-胡椒基)哌嗪,N-环己基哌嗪,环丙胺反应得化合物29~34。化合物35与乙基哌嗪,N-(2-吡啶)哌嗪,N-(2-吡嗪基)哌嗪,N-(2-胡椒基)哌嗪,环丙胺反应得化合物36~40。

  化合物19:白色粉末,ESI-MS:m/z 564.1[M+H]+;

  化合物20:白色粉末,ESI-MS:m/z 613.4[M+H]+;

  化合物21:白色粉末,ESI-MS:m/z 614.3[M+H]+;

  化合物22:白色粉末,ESI-MS:m/z 670.4[M+H]+;

  化合物24:白色粉末,ESI-MS:m/z 580.2[M+H]+;

  化合物25:白色粉末,ESI-MS:m/z 629.4[M+H]+;

  化合物26:白色粉末,ESI-MS:m/z 630.4[M+H]+;

  化合物27:白色粉末,ESI-MS:m/z 686.2[M+H]+;

  化合物29:白色粉末,ESI-MS:m/z 566.2[M+H]+;

  化合物30:白色粉末,ESI-MS:m/z 615.1[M+H]+;

  化合物31:白色粉末,ESI-MS:m/z 616.2[M+H]+;

  化合物32:白色粉末,ESI-MS:m/z 672.2[M+H]+;

  化合物33:白色粉末,ESI-MS:m/z 620.5[M+H]+;

  化合物34:白色粉末,ESI-MS:m/z 509.4[M+H]+;

  化合物36:白色粉末,ESI-MS:m/z 562.3[M+H]+;

  化合物37:白色粉末,ESI-MS:m/z 611.2[M+H]+;

  化合物38:白色粉末,ESI-MS:m/z 612.4[M+H]+;

  化合物39:白色粉末,ESI-MS:m/z 668.4[M+H]+;

  化合物40:白色粉末,ESI-MS:m/z 507.3[M+H]+;

  实施例6:

  将45mg(0.11mmol)环杷明溶于5mL CHCl3中,加入2′,4′-二氟苯甲酰氯0.2mL(1.6mmol),TEA0.5mL,室温反应12h,反应结束后,加入80mL乙酸乙酯,用3×30mL的水洗涤,有机层用30mL饱和食盐水洗涤,用无水Na2SO4干燥。蒸除溶剂得粗产物55mg,经硅胶短柱纯化得到化合物46(32.3mg),收率53.5%。

  相同的操作,以3-羰基-Δ4-环杷明为原料反应得到47。

  化合物46:白色粉末,ESI-MS:m/z 552.1[M+H]+;

  化合物47:

  白色粉末,ESI-MS:m/z 550[M+H]+,1H-NMR(600MHz,CDCl3,J/Hz)δ:7.12(dd,1H,J=11.4,3.6,H-6′),7.09(d,1H,J=4.8,H-5′),7.07(d,1H,J=4.8,H-3′),5.78(brs,1H,H-4),3.80(d,1H,J=4.8,H-23),3.56(m,1H,H-3b),3.51(m,1H,H-3a),3.04(brs,1H,H-26b),2.93(m,1H,H-22),1.77(s,3H,H-18),1.16(d,1H,J=6.6,H-21),1.15(d,3H,H-27),1.11(s,3H,H-19);13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:199.5(3-C=O),172.1(C=O),170.7(C-5),166.1(C-4′),160.2(C-2′),142.1(C-13),127.6(C-12),124.7(C-4),116.3(C-1′),105.3(C-3′),85.6(C-17),71.4(C-23),63.0(C-22),54.8(C-9),48.0(C-14),45.2(C-26),44.6(C-8),38.3(C-10),36.3(C-1),33.8(C-6),32.8(C-2),32.3(C-16),30.5(C-7),28.8(C-11),28.1(C-25),24.4(C-15),16.2(C-27),16.2(C-19),13.6(C-18),10.2(C-21).

  实施例7:

  将1.23g(3.0mmol)藜芦胺溶于15mL DMF中,加入BrCH2CH2Br6mL(69mmol),K2CO31.0g(7.2mmol)和催化量的KI,反应36h,反应结束后,加入200mL乙酸乙酯,用3×100mL的水洗涤,有机层用100mL饱和食盐水洗涤,用无水Na2SO4干燥。蒸除溶剂得粗产物1.30g,经硅胶短柱纯化得到化合物48(1.12g),收率73.5%。

  类似的操作,介芬胺与3-羰基-Δ4-藜芦胺分别与ClCH2CH2Cl和BrCH2CH2Br反应得到51,52和59,60;环杷明与3-羰基-Δ4-环杷明与ClCH2CH2Cl或BrCH2CH2Br反应61和67,68。

  化合物48:白色粉末,ESI-MS:m/z 516.2[M+H]+;

  化合物51:白色粉末,ESI-MS:m/z 488.3[M+H]+;

  化合物59:白色粉末,ESI-MS:m/z 532.2[M+H]+;

  化合物60:白色粉末,ESI-MS:m/z 514.2[M+H]+;

  化合物67:白色粉末,ESI-MS:m/z 472.3[M+H]+;

  化合物68:白色粉末,ESI-MS:m/z 516.2[M+H]+;

  化合物52:

  白色粉末,ESI-MS:m/z 532[M+H]+,1H-NMR(600MHz,CDCl3,J/Hz)δ:5.36(t,1H,J=2.4,H-6),3.53(m,1H,H-3),3.51(m,1H,H-23),3.51(m,2H,H-2′),3.07(m,1H,H-26b),3.02(m,1H,H-1′),2.57(d,1H,J=7.8,H-22),2.48(m,1H,H-20),2.46(m,1H,H-1b),2.37(d,1H,J=1.8,H-4b),2.35(dd,1H,J=4.8,2.4,H-26a),2.00(brs,1H,H-26a),2.28(m,1H,H-4a),2.05(s,3H,H-18),2.18(d,1H,J=4.2,H-24b),1.97(m,1H,H-1a),1.36(m,1H,H-25),1.22(d,1H,J=3.0,H-24a),1.04(d,1H,J=7.2,H-27),1.02(s,3H,H-19),0.98(d,3H,J=6.6,H-27);13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:206.9(11-C=O),144.0(C-13),142.3(C-5),136.0(C-12),121.0(C-6),85.0(C-17),74.8(C-23),71.7(C-3),71.5(C-22),52.6(C-9),61.8(C-26),57.4(C-1′),44.8(C-14),41.4(C-4),40.4(C-8),37.7(C-24),37.0(C-10),36.8(C-1),31.6(C-16),31.2(C-7),30.7(C-2),29.3(C-25),29.3(C-2′),24.3(C-15),19.0(C-27),18.5(C-19),12.2(C-18),10.8(C-21).

  化合物61:

  白色粉末,ESI-MS:m/z 518[M+H]+,1H-NMR(600MHz,CDCl3,J/Hz)δ:5.38(d,1H,J=5.4,H-6),3.52(m,1H,H-3),3.45(m,2H,H-CH2Br),3.10(m,1H,H-23),3.01(m,1H,H-26b),2.86(m,2H,H-CH2CH2Br),2.41(m,1H,H-22),2.25(m,1H,H-4b),2.21(m,1H,H-4a),2.18(m,1H,H-20),1.68(brs,3H,H-18),1.02(m,3H,H-21),0.98(d,1H,J=6.6,H-27),0.94(brs,3H,H-19).

  实施例8:

  将50.7mg(0.1mmol)48溶于10mL DMF中,加入乙基哌嗪0.5mL(40mmol),K2CO3140mg(1.0mmol),逐渐升温至65℃,反应过夜,反应结束后加入80mL乙酸乙酯,用3×40mL的水洗涤,有机层用40mL的饱和食盐水洗涤,用无水Na2SO4干燥。蒸除溶剂得粗产物45mg,经硅胶柱分离得到化合物49(30mg),收率54.6%。

  类似的操作,化合物48与环丙胺反应得到50;化合物52与乙基哌嗪,N-(2-吡啶)哌嗪,N-(2-吡嗪基)哌嗪,N-(2-胡椒基)哌嗪,N-环己基哌嗪,环丙胺反应的化合物53~58;化合物61乙基哌嗪,N-(2-吡啶)哌嗪,N-(2-吡嗪基)哌嗪,N-(2-胡椒基)哌嗪,环丙胺反应的化合物62~66;化合物52,61,68与二甲胺反应得到77~79。

  化合物49:白色粉末,ESI-MS:m/z 550.4[M+H]+;

  化合物50:白色粉末,ESI-MS:m/z 493.3[M+H]+;

  化合物53:白色粉末,ESI-MS:m/z 566.4[M+H]+;

  化合物54:白色粉末,ESI-MS:m/z 615.2[M+H]+;

  化合物55:白色粉末,ESI-MS:m/z 616.1[M+H]+;

  化合物56:白色粉末,ESI-MS:m/z 672.2[M+H]+;

  化合物57:白色粉末,ESI-MS:m/z 620.5[M+H]+;

  化合物62:白色粉末,ESI-MS:m/z 552.5[M+H]+;

  化合物63:白色粉末,ESI-MS:m/z 601.4[M+H]+;

  化合物64:白色粉末,ESI-MS:m/z 602.4[M+H]+;

  化合物65:白色粉末,ESI-MS:m/z 672.3[M+H]+;

  化合物66:白色粉末,ESI-MS:m/z 509.4[M+H]+;

  化合物77:白色粉末,ESI-MS:m/z 497.4[M+H]+;

  化合物78:白色粉末,ESI-MS:m/z 483.4[M+H]+;

  化合物79:白色粉末,ESI-MS:m/z 481.3[M+H]+;

  化合物58:

  白色粉末,ESI-MS:m/z 509[M+H]+,1H-NMR(600MHz,CDCl3,J/Hz)δ:5.38(d,1H,J=5.4,H-6),3.53-3.54(m,2H,H-3,23),3.10(m,2H,H-2′),3.05(d,1H,J=17.4,H-26b),3.01(m,2H,H-1′),2.59(d,1H,J=2.4,H-22),2.48(m,1H,H-20),2.35(m,1H,H-26a),2.28(brs,3H,H-18),1.35(m,1H,H-1″),1.08(d,3H,J=6.6,H-27),1.02(brs,3H,H-19),0.99(d,1H,J=6.6,H-21),0.57(m,4H,H-2″,3″).

  实施例9:

  将82mg(0.2mmol)3-羰基-Δ4-藜芦胺溶于15mL乙醇中,加入K2CO3140mg(1.0mmol)和0.5mL CH3I(1.6mmol)。于40℃反应过夜。用3×50mL乙酸乙酯萃取,有机层用无水Na2SO4干燥,蒸除溶剂得到78mg粗品,经硅胶柱纯化得到白色晶体(化合物71)26mg;水层浓缩至1mL,经Sephadex LH-20柱层析,以甲醇洗脱,得到颗粒状的晶体(化合物72)15mg。

  类似的操作,介芬胺,环杷明与CH3I得到化合物69,70。

  化合物69:白色粉末,ESI-MS:m/z 454.3[M]+;

  化合物70:白色粉末,ESI-MS:m/z 440.4[M]+;

  化合物71:白色粉末,ESI-MS:m/z 422.3[M+H]+;

  化合物72:白色粉末,ESI-MS:m/z 436.3[M]+;

  实施例10:

  将82mg(0.2mmol)藜芦胺溶于15mL CH2Cl2中,加入75%的间氯过氧苯甲酸(mPCA)92mg(0.4mmol)。于10℃以下反应过夜。反应结束后加入5%的Na2CO3溶液调pH至7-8,用3×50mL CH2Cl2萃取,有机层用无水Na2SO4干燥。蒸除溶剂得78mg粗品,经硅胶柱纯化得白色晶体8651mg。

  类似的操作,分别以介芬胺,环杷明,3-羰基-Δ4-藜芦胺,3-羰基-Δ4-介芬胺,3-羰基-Δ4-环杷明为原料,经间氯过氧苯甲酸氧化得到化合物87~91。

  化合物86:

  白色粉末,ESI-MS:m/z 426[M+H]+,1H-NMR(600MHz,CDCl3,J/Hz)δ:7.31(brs,1H,H-16),6.90(d,1H,J=8.4,H-15),5.45(t,1H,J=2.4,H-6),3.96(m,1H,H-20),3.65(m,1H,H-23),3.45(m,1H,H-3),3.17(m,1H,H-26b),2.90(td,1H,J=12.0,5.4,H-8),2.76(q,1H,J=7.2,H-11b),2.57(m,1H,H-11a),2.54(m,1H,H-7b),2.44(d,1H,H-22),2.36(m 1H,H-4b),2.33(brs,3H,H-18),2.21(m,1H,H-4a),2.20(m,1H,H-26b),1.96(tt,1H,J=14.4,2.4,H-7a),1.86(d,1H,J=3.0,H-1b),1.84(m,1H,H-2b),1.82(m,1H,H-24b),1.77(m,1H,H-9),1.65(m,1H,H-25),1.96(dd,1H,J=12.0,3.0,H-2a),1.43(d,3H,J=6.6,H-21),1.27(d,1H,J=3.6,H-1a),1.12(brs,3H,H-19),0.90(m,1H,H-24a),0.87(d,3H,J=6.0,H-27);13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:144.4(C-14),143.7(C-12),143.5(C-5),142.4(C-17),133.4(C-13),126.7(C-16),122.6(C-6),120.3(C-15),75.8(C-22),72.2(C-3),58.2(C-9),43.1(C-24),42.3(C-4),42.1(C-8),40.0(C-1),37.8(C-10),34.7(C-20),31.7(C-7),31.3(C-11),31.0(C-2),27.6(C-25),19.6(C-19),19.3(C-27),16.2(C-18),14.6(C-21).

  化合物87:

  白色粉末,ESI-MS:m/z442[M+H]+,1H-NMR(600MHz,CDCl3,J/Hz)δ:5.38(brs,1H,H-6),3.50(m,1H,H-3),3.48(m,1H,H-23),2.85(dd,1H,J=10.0,4.0,H-26b),2.66(m,1H,H-22),2.64(m,1H,H-20),2.57(dd,1H,J=13.0,3.0,H-1b),2.34(m,1H,H-4b),2.23(m,1H,H-26a),2.21(brs,3H,H-18),2.17(brs,1H,H-4a),2.05(m,1H,H-24b),1.94(m,1H,H-14),1.92(m,1H,H-15b),1.85(m,1H,H-7b),1.78(m,1H,H-25),1.62(m,1H,H-9),1.56(m,1H,H-8),1.35(m,1H,H-15a),1.19(d,1H,J=3.0,H-1a),1.13(s,1H,H-24a),1.10(d,3H,J=7.0,H-21),1.03(brs,3H,H-19),1.02(d,1H,J=7.0,H-27);13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:206.8(C-11),145.9(C-13),142.3(C-5),137.2(C-12),120.9(C-6),85.5(C-17),76.1(C-22),74.2(C-23),71.7(C-3),67.6(C-26),62.6(C-9),44.8(C-14),41.4(C-4),40.8(C-20),37.9(C-8),37.3(C-24),37.0(C-10),36.8(C-1),31.2(C-2),31.1(C-7),30.7(C-16),28.8(C-25),24.4(C-15),18.7(C-27),18.5(C-19),12.3(C-18),11.1(C-21).

  化合物88:

  白色粉末,ESI-MS:m/z428[M+H]+,1H-NMR(600MHz,CDCl3,J/Hz)δ:5.37(brs,1H,H-6),3.53(d,1H,J=5.4,H-3),3.39(m,1H,H-23),3.27(d,1H,J=8.4,H-26b),2.60(m,1H,H-22),2.14(m,1H,H-20),2.10(m,1H,H-1b),2.44(m,1H,H-4b),2.35(m,1H,H-26a),1.67(brs,3H,H-18),2.20(brs,1H,H-4a),1.25(m,1H,H-24b),1.46(m,1H,H-14),1.38(m,1H,H-25),1.29(d,1H,J=3.0,H-1a),1.18(s,1H,H-24a),1.08(d,3H,J=7.2,H-21),1.00(d,1H,J=8.4,H-27),0.93(brs,3H,H-19).

  化合物89:白色粉末,ESI-MS:m/z 424.3[M+H]+;

  化合物90:白色粉末,ESI-MS:m/z 440.3[M+H]+;

  化合物91:白色粉末,ESI-MS:m/z 426.3[M+H]+;

  实施例11:

  将41mg(0.1mmol)藜芦胺溶于5mLAcOH中,加入液溴0.1mL(3.9mmol)。于25℃以下反应24h。反应结束后加入饱和的Na2CO3溶液调pH至7-8,用3×50mL乙酸乙酯萃取,有机层用无水Na2SO4干燥。蒸除溶剂得到38mg粗品,经硅胶柱纯化得到黄白色粉末9231mg,收率54.5%。

  类似的操作,以介芬胺为原料加成反应得到化合物93。

  化合物92:白色粉末,ESI-MS:m/z 568.1[M+H]+;

  化合物93:白色粉末,ESI-MS:m/z 584.3[M+H]+;

  实施例12:

  体外化合物对胰腺癌细胞和肺癌细胞增殖的抑制作用

  样品配制:将本发明各化合物用DMSO(Merck)溶解后,加入PBS(-)配成1000μg/mL的溶液,然后用含DMSO的PBS(-)稀释。

  细胞株:

  1)BxPC-3(人胰腺癌细胞) 2)SW1990(人胰腺癌细胞)

  3)NCI-H157(非小细胞肺癌细胞) 4)NCI-H466(小细胞肺癌细胞)

  培养液RPMI1640+15%NBS+双抗

  试验方法

  MTT法:96孔板每孔加入浓度为3~4×104个/mL的细胞悬液100μL,置37℃,5%CO2培养箱内。24h后,加入样品液,10μL/孔,设双复孔,37℃,5%CO2作用72h。每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL,作用4h后加入溶解液,100μL/孔,置培养箱内,溶解后用MK-2全自动酶标仪测570nm OD值。

  结果见表1。结果表明化合物对胰腺癌细胞和肺癌细胞具有一定的抑制作用,并且呈一定的选择性。绝大部分化合物对胰腺癌BxPC-3和小细胞肺癌NCI-H446细胞系敏感,表现出良好的抑制细胞增殖的活性,而对胰腺癌细胞SW1990和非小细胞肺癌NCI-H157细胞系敏感程度相对较差。部分化合物对于胰腺癌肺癌细胞的抑制作用明显强于阳性对照药环杷明。

  尤其化合物41,43,58具有显著的抗肿瘤活性,其他8个衍生物:10,18,19,38,45,48,50,65也表现出明显的抗肿瘤活性。

  并且表现出一定的选择性:对于胰腺癌BxPC-3和小细胞肺癌NCI-H446细胞系的敏感性大于胰腺癌细胞SW1990和非小细胞肺癌NCI-H157细胞。

  表1.介芬胺类生物碱衍生物对胰腺癌、肺癌细胞瘤株增殖抑制作用

  环杷明*:阳性对照药

  实施例13:

  化合物41,44,58对裸鼠体内人体胰腺癌PANC-1瘤的抑制作用

  受试样品:化合物41,44,58,纯度均>95%,用数滴土温-80助溶后加0.5%CMC制成所需浓度

  阳性对照药物:cyclopamine(自制,纯度>98.5%)

  实验动物:BALB/C裸鼠(SPF级),雄性,18-20g,由上海斯莱克实验动物责任有限公司购得。

  移植性肿瘤:人体胰腺癌PANC-1,由上海医药工业研究院药理室提供。

  实验方法:

  取生长良好的PANC-1实体瘤,无菌条件下切割成2-3mm大小的均匀小块,用套管针每只小鼠右腋皮下接种一块,随机分为5组,分别为:

  (1)Control(生理盐水) (2)cyclopamine(20mg/kg,ip×10)

  (3)41(2mg/kg,ip×10) (4)41(5mg/kg,ip×10)

  (5)41(10mg/kg,ip×10) (6)43(3mg/kg,ip×10)

  (7)43(10mg/kg,ip×10) (8)43(20mg/kg,ip×10)

  (9)58(3mg/kg,ip×10) (10)58(10mg/kg,ip×10)

  (11)58(20mg/kg,ip×10)

  接种后10日开始给药,各给药组分别连续腹腔注射给药10天(d0-d9),给药体积为0.5mL/20g体重,并用电子数显游标卡尺每4天测瘤块的长径(a)、短径(b),计算肿瘤体积(tumor volume,TV)计算公式为:TV=1/2×a×b2,相对肿瘤体积(relative tumor volume,RTV)计算公式为:RTV=Vt/Vo,Vo为分笼时(即do)测量所得肿瘤体积,Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖抑制率(%):(1-T/C)×100%,并进行T检验。接种后30天脱颈处死动物,解剖取瘤块,称瘤重,计算瘤重抑瘤率。

  结果与讨论:

  选取体外细胞毒实验中有较强抑制作用的化合物:41,43,58进行体内抗肿瘤活性研究,结果见表2。

  表2.化合物41,44,58对裸鼠体内人体胰腺癌PANC-1瘤的抑制作用

  环杷明*:阳性对照药

  从表2.可以看出,41在低、中、高三个剂量时的抑制率分别为28.11%,28.61%,40.02%,和空白组比较其抑制作用非常显著,其p<0.01,高剂量时的效果和阳性对照药相当,并且高剂量组中未发现小鼠死亡现象,其生理状态正常,说明41体内的毒性较轻;

  58在低、中、高三个剂量时的抑制率分别为14.98%,34.35%,39.52%,中、高剂量组和空白组比较其抑制作用非常显著,其p<0.01,高剂量时的效果和阳性对照药相当,并且高剂量组中未发现小鼠死亡现象,其生理状态正常,说明58体内的毒性较轻;

  43在低、中、高三个剂量时的抑制率分别为12.90%,29.19%,39.45%,只有高剂量组和空白组比较其抑制作用非常显著,其p<0.01,高剂量时的效果和阳性对照药相当,并且高剂量组中未发现小鼠死亡现象,其生理状态正常,说明43体内的毒性较轻,并且表现出较好的量效关系。

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