化学合成麻黄素 篇1：
一种分离纯化大麻黄素的方法
第一、技术领域
本发明涉及植物活性成分提取技术领域，具体涉及一种分离纯化大麻黄素的方法。
第二、背景技术
工业大麻(Stevia rebaudiana Bertoni)为大麻科大麻属一年生雌雄异株的草本植物，广泛分布于世界各地。世界上大麻属植物主要有野生大麻(CannabisruderalisJanisch)、印度大麻(Cannabis indica Lam)和栽培大麻(Cannabis sativaL)3个种，在长期的生物进化过程中又产生了许多大麻变种和亚种。由于大麻中含有一种致幻成瘾的次生代谢产物—四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol，THC)，因而成为公众熟知的毒品原植物之一。为了方便监管和合理使用，国际上将大麻中THC含量<0 .3%的大麻品种定义不具备毒品利用价值的工业大麻。目前世界上种植工业大麻的国家已达27个，培育出的符合THC含量<0 .3%的工业大麻品种26个。
工业大麻又称汉麻，汉麻全身都是宝主要有纺织、食用和药用三大功能。汉麻皮富含纤维，可用于服装及各种饰品加工; 汉麻杆芯是极佳的木材替代品，还可用来生产超微粉; 汉麻籽富含优质蛋白以及人体必需脂肪酸，可应用于食品、保健品等领域。从大麻的叶、花及花粉中分离得到的已知黄酮类化合物有20多种，它们可以被糖基化、异戊烯基化或甲基化。2002年，McPartland等分离得到了共轭O-糖苷化合物：芹菜素(apigenin)、木犀草素(luteolin)、槲皮素(quercetin)和山奈酚(kaempferol);同年，Vanhoenacker等分离得到了C-糖苷化合物：荭草苷(orientin)、紫杉醇(vitexin)、木犀草素-7-O-葡萄糖苷(luteolin-7-O-glucoside)和芹菜素-7-O-葡糖苷(apigenin-7-O-glucoside)。此外，大麻中特有的化合物大麻黄素A、大麻黄素B、大麻黄素C。大麻黄素，是大麻中的一类化合物，在化学上属于丙烯基黄酮类，与THC或CBD等大麻素没有关系。大麻黄素A和B属于黄酮类化合物，在1985年被发现，大麻黄素C在2008年被发现。当时已经确认其具有消炎作用，同等质量下比乙酰水杨酸(阿司匹林)的药效强近30倍。大麻黄素A和大麻黄素 B具有抑制类风湿的功效;大麻黄素A和B在体外对前列腺素E有抑制作用，因此很多研究探讨了其在消炎方面的潜力。目前从汉麻叶和汉麻果胶中提取总黄酮工艺已见报道，但实现工业化提取的并不多见。本发明采用甲醇水溶液提取配合柱层析分离纯化，对汉麻叶总黄酮的提取工艺进行优化，以探寻汉麻叶总黄酮的最适提取条件，目的在于研发一个适合工业化大规模生产的工艺，旨在为充分利用汉麻叶中的生物活性成分，实现汉麻资源的综合利用和效益最大化提供指导。
第三、发明内容
针对现有提取方法中大麻黄素提取率低、纯度低，易失活等问题，本发明提供了一种分离纯化大麻黄素的方法，包括如下步骤：
1、将大麻花叶粉碎制成颗粒，加入纤维素酶进行酶解，获得纤维素酶酶解大麻花叶。
2、向步骤1获得的酶解大麻花叶中加入乙醇水溶液，进行低温提取，获得提取液;所述的乙醇水溶液为(20-50%)，低温提取温度为45-58℃，时间为30-60min。
3、过滤步骤2获得的提取液，过滤后低温减压浓缩至1/5体积，获得浓缩液;所述的低温减压浓缩温度为45-60℃，真空度为0.05-0.078MPa。
4、向步骤3中获得的浓缩液加入NaOH水溶液，调节PH值至5-6;调至碱性后加入正己烷萃取，合并萃取液，浓缩抽干;所述的NaOH水溶液为2-4%，每次加入正己烷的量为浓缩液的1.6-2.4倍，萃取次数为2-3次。
5、加压过滤步骤4得到的水相液，获得粗滤液。
6、将步骤5得到的粗滤液用膜过滤，得到的滤液低温减压浓缩至1/5体积，获得大麻黄酮浓缩液。
7、步骤6获得的大麻黄酮浓缩液，通过柱层析分离得到大麻黄素。
8、将步骤7分离得到的大麻黄素低温减压浓缩抽干，获得大麻黄素晶体;所述的低温减压浓缩温度为45-60℃，真空度为0.05-0.078MPa。
9、将步骤8得到的大麻黄素晶体，用分析纯级乙醇水溶液溶解，低温减压回收溶剂，结晶，获得大麻黄素结晶液。
10、过滤步骤9得到的结晶液，得到高纯度大麻黄素晶体，将所得晶体真空低温干燥，获得大麻黄素纯品。
进一步地限定，步骤1)所述大麻花叶粉碎制成的颗粒为30-50目。
更进一步地限定，步骤1)所述的加入纤维素酶进行酶解，所用纤维素酶的酶解活力单位1000U/g，加入量为：0 .1-0 .2g/kg果浆;酶解pH：4 .5-6 .5，酶解温度45-55℃，时间为40-50min。
进一步地限定，步骤2)所述大麻花叶与乙醇的料液比为1g:(4-6)mL。
进一步地限定，步骤5)所述加压过滤压力为0.2MPa，滤网为1000目。
进一步地限定，步骤6)所述过滤是指将粗滤液经过分子量为1000D的中空纤维膜过滤。
进一步地限定，步骤7)所述层析是指通过大孔树脂柱洗脱的方法进行纯化。
更进一步地限定，步骤7)所述大孔树脂为AB-8、HDX-5、X-5或DX101。
进一步地限定，步骤10)所述干燥为真空冻干干燥，真空度0 .07-0 .08MPa ,真空冻干温度-65--50℃，冻干时间24-28h。
本发明采用酶解配合低温醇提的方法提取大麻黄素，解决了大麻黄素提取率低、失活、色价与纯度不高等问题，取得的有益效果如下所述：
1 .以往大麻黄素提取之前仅仅进行粉碎处理，很难保证在提取过程中，大麻黄素从花叶纤维素中能充分释放，本发明在提取前采用纤维素酶解的方法，通过纤维素酶使花叶纤维素解链，将大麻黄素释放，进而通过提取使大麻黄素充分释放。
2 .以往大麻黄素提取均采用溶剂提取法，提取得到的提取液往往含有较多大麻素，本发明采用低温低醇的提取方法，解决了提取液中大麻素过多的问题。
3 .本发明与常规方法相比纯度由25%提高至60%，纯度增加35%。
第四、附图说明
图1本发明与常规方法大麻黄素提取率的比较。
图2本发明与常规方法大麻黄素纯度比较。
图3本发明与常规方法提取液中大麻素的比较。
第五、具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
本具体实施方式采用以下技术方案：
实施例1
大麻黄素分离纯化方法
1、取大麻花叶1000g，用高速粉碎机粉碎，粉碎粒度40目，获得大麻花叶颗粒。
2、然后以1g：4mL的料液比加入体积分数30%的乙醇水溶液，搅拌提取，获得提取液。所述提取温度为48℃，时间为40min，提取2次。
3、在提取结束后将提取液进行过滤，除去滤渣，取过滤液放入浓缩器中，进行溶剂回收，回收溶剂后，提取液浓缩至原体积的20%;减压浓缩温度为52℃，真空度为0.072MPa。
4、步骤3中获得的浓缩液放置冷却，加入2%NaOH水溶液，调节PH值至5-6;加入正己烷萃取，合并萃取液，浓缩抽干;每次加入正己烷的量为浓缩液的2倍，萃取次数为2次。
5、将萃取后的水相倒入到1000目过滤罐中，加压至0.2MPa过滤，获得粗滤液。
6、得到的粗滤液用分子量为1000D的中空纤维膜过滤，得到的滤液低温减压浓缩至1/5体积，获得大麻黄酮浓缩液。
7、获得的大麻黄酮浓缩液，通过柱层析分离得到大麻黄素;所用填料为大孔树脂AB-8。
8、将分离得到的大麻黄素溶液，低温减压浓缩抽干，获得大麻黄素晶体;所述的低温减压浓缩温度为52℃，真空度为0.072MPa。
9、得到的大麻黄素晶体，按料比1:3加入乙醇水溶液溶解，溶解完全后低温减压回收溶剂，浓缩至大麻黄素晶体析出，放置冷却获得大麻黄素结晶液。
10、用玻砂漏斗过滤结晶液，得到高纯度大麻黄素晶体，将所得晶体放入干燥箱中，真空度0 .08MPa ,真空冻干温度-65℃，冻干时间28h，得大麻黄素成品。
实施例2
大麻黄素分离纯化方法
1、取大麻花叶1000g，用高速粉碎机粉碎，粉碎粒度40目，然后加活力单位为1000U/g的纤维素酶，加入量为0 .1g/kg大麻花叶，在pH4 .5，温度为45℃，搅拌桨转数为20转/min，搅拌40min进行酶解，获得纤维素酶酶解花叶。
2、然后以1g：4mL的料液比加入体积分数30%的乙醇水溶液，搅拌提取，获得提取液。所述提取温度为48℃，时间为40min，提取2次。
3、在提取结束后将提取液进行过滤，除去滤渣，取过滤液放入浓缩器中，进行溶剂回收，回收溶剂后，提取液浓缩至原体积的20%;减压浓缩温度为52℃，真空度为0.072MPa。
4、步骤3中获得的浓缩液放置冷却，加入2%NaOH水溶液，调节PH值至5-6;加入正己烷萃取，合并萃取液，浓缩抽干;每次加入正己烷的量为浓缩液的2倍，萃取次数为2次。
5、将萃取后的水相倒入到1000目过滤罐中，加压至0.2MPa过滤，获得粗滤液。
6、得到的粗滤液用分子量为1000D的中空纤维膜过滤，得到的滤液低温减压浓缩至1/5体积，获得大麻黄酮浓缩液。
7、获得的大麻黄酮浓缩液，通过柱层析分离得到大麻黄素;所用填料为大孔树脂HDX-5。
8、将分离得到的大麻黄素溶液，低温减压浓缩抽干，获得大麻黄素晶体;所述的低温减压浓缩温度为52℃，真空度为0.072MPa。
9、得到的大麻黄素晶体，按料比1:3加入乙醇水溶液溶解，溶解完全后低温减压回收溶剂，浓缩至大麻黄素晶体析出，放置冷却获得大麻黄素结晶液。
10、用玻砂漏斗过滤结晶液，得到高纯度大麻黄素晶体，将所得晶体放入干燥箱中，真空度0 .08MPa ,真空冻干温度-65℃，冻干时间28h，得大麻黄素成品。
实施例3
大麻黄素分离纯化方法
1、取大麻花叶1000g，用高速粉碎机粉碎，粉碎粒度40目，然后加活力单位为1000U/g的纤维素酶，加入量为0 .1g/kg大麻花叶，在pH4 .5，温度为45℃，搅拌桨转数为20转/min，搅拌40min进行酶解，获得纤维素酶酶解花叶。
2、然后以1g：4mL的料液比加入体积分数30%的乙醇水溶液，搅拌提取，获得提取液。所述提取温度为48℃，时间为40min，提取2次。
3、在提取结束后将提取液进行过滤，除去滤渣，取过滤液放入浓缩器中，进行溶剂回收，回收溶剂后，提取液浓缩至原体积的20%;减压浓缩温度为52℃，真空度为0.072MPa。
4、步骤3得到的浓缩液倒入到1000目过滤罐中，加压至0.2MPa过滤，获得粗滤液。
5、得到的粗滤液用分子量为1000D的中空纤维膜过滤，得到的滤液低温减压浓缩至1/5体积，获得大麻黄酮浓缩液。
6、获得的大麻黄酮浓缩液，通过柱层析分离得到大麻黄素;所用填料为大孔树脂HDX-5。
7、将分离得到的大麻黄素溶液，低温减压浓缩抽干，获得大麻黄素晶体;所述的低温减压浓缩温度为52℃，真空度为0.072MPa。
8、得到的大麻黄素晶体，按料比1:3加入乙醇水溶液溶解，溶解完全后低温减压回收溶剂，浓缩至大麻黄素晶体析出，放置冷却获得大麻黄素结晶液。
9、用玻砂漏斗过滤结晶液，得到高纯度大麻黄素晶体，将所得晶体放入干燥箱中，真空度0 .08MPa ,真空冻干温度-65℃，冻干时间28h，得大麻黄素成品。
实施例1与实施2相比较：
实施例1的方法为乙醇水溶液提取配合大孔树脂层析方法提取大麻黄素，与本申请的不同在于大麻花叶没有经过酶解处理。
实施例3与实施2相比较：
实施例3的方法为乙醇水溶液提取配合大孔树脂层析方法提取大麻黄素，与本申请的不同在于提取液没有经萃取就进行柱层析。
通过上述实施例对比分析可得：本发明具有提取率高，得到的大麻黄素纯度高，且不含有大麻素等优点。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
化学合成麻黄素 篇2：
一种木麻黄素的制备方法
第一、技术领域
本发明涉及一种木麻黄素的制备方法，尤其涉及一种应用高速逆流色谱法从旌节花植物中分离制备木麻黄素的方法。
第二、背景技术
旌节花(Stachyurus praecox Sieb.et Zucc.)是旌节花科(Stachyuraceae)植物，该科植物是被子植物门木兰纲堇菜目下的一个科，多为灌木或小乔木，有时为攀援状灌木。该科约有200种，该科为东亚特有科，仅1属，有15种。主要分布中心为中国的西南地区和日本。中国有11种，分布于秦岭以南的广大地区，而以西南地区(云南和四川)为最盛。该科植物喜马山旌节花、云南旌节花、柳叶旌节花和中国旌节花等的茎、枝髓常代传统中药通草入药，有利尿、催乳、清湿热的功能。
木麻黄素(Casuarictin)：类白色无定形粉末，[α]D+35.2°(c=0.2，甲醇)。分子式：C41H28O26，分子量：936.65，木麻黄素属于鞣质类物质，具有细胞毒活性和抗肿瘤活性。其对黑色素瘤RPMI-7951的ED50为0.51μg/mL;且在10mg/kg时，对荷S-180小鼠的延命率为75.8%。该药物的多种药理作用是其的开发具有重要的意义。
目前，已有木麻黄素的分离方法较少，多是硅胶柱和凝胶柱相结合，方法繁琐，重现性差，制备量较小，专属性低。
高速逆流色谱技术(HSCCC)是一种不需任何载体的液液分配分离技术，利用单向流体动力学平衡原理，基于样品在旋转螺旋管内的相对移动而互不混溶的两相中分配系数的不同而实现分离，其分离效率和速度可以与HPLC相媲美。HSCCC分离效率高，产品纯度高，不存在载体对样品的吸附和污染，制备量大和溶剂消耗少，操作简单，能从极复杂的混合物中分离出特定的组分。它与一般色谱的分离方式不同，特别适用于制备级的分离，已被广泛应用于中药与天然产物的分离纯化过程中。
第三、发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种木麻黄素的制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
(1)取旌节花科植物的叶粉碎，用50-80%乙醇溶液提取2-4次，减压回收乙醇得到浓缩液;
(2)将浓缩液用有机溶剂萃取，萃取物采用硅胶柱层析，用氯仿-甲醇洗脱，收集流分浓缩干燥得到粗提物;
(3)上述粗提物采用高速逆流色谱法进行分离，将乙酸乙酯-正丁醇-0.004M三氟乙酸(3-7：8-15：15)组成的溶剂系统在分液漏斗中充分振荡后静置，分层，上相为固定相，下相为流动相，根据检测器紫外光谱图进行收集，合并相同成分，得到木麻黄素单体。
所述步骤(1)中提取方法可选超声波提取或回流提取。
所述步骤(2)中有机溶剂为正丁醇，氯仿-甲醇的体积比为3-7:4。
本发明的优点在于：
1、步骤少，耗时短，得率高，易于规模化生产;
2、工序简单，易于控制，溶剂利用率高，分离效率高;
3、本发明采用高速逆流色谱法，没有可逆吸附，样品无损失;
4、本发明制备得到的高纯度的单体成分可作为对照品使用。
下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
第四、具体实施方式
实施例1
取旌节花科植物的叶1kg，粉碎，用80%乙醇溶液超声波提取4次，减压回收乙醇得到浓缩液，用正丁醇萃取，萃取液回收正丁醇，再采用硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(3:4)洗脱，收集流分浓缩干燥得到粗提物。将乙酸乙酯-正丁醇-0.004M三氟乙酸(3：8：15)组成的溶剂系统在分液漏斗中充分振荡后静置，分层，上相为固定相，下相为流动相，使进样阀处于进样状态，将固定相以10ml/min的流速灌满逆流色谱仪的色谱分离柱，开启速度控制器，使螺旋管柱顺时针方向旋转，当色谱仪转速为850r/min时，以流速为2.5ml/min泵入流动相，将粗提物用下相溶解，并通过进样阀进样，根据检测器紫外光谱图进行收集，合并相同成分，得到木麻黄素单体95mg。
实施例2
取旌节花科植物的叶1kg，粉碎，用50%乙醇溶液回流提取2次，减压回收乙醇得到浓缩液，用正丁醇萃取，萃取液回收正丁醇，再采用硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(7:4)洗脱，收集流分浓缩干燥得到粗提物。将乙酸乙酯-正丁醇-0.004M三氟乙酸(7：15：15)组成的溶剂系统在分液漏斗中充分振荡后静置，分层，上相为固定相，下相为流动相，使进样阀处于进样状态，将固定相以10ml/min的流速灌满逆流色谱仪的色谱分离柱，开启速度控制器，使螺旋管柱顺时针方向旋转，当色谱仪转速为850r/min时，以流速为2.5ml/min泵入流动相，将粗提物用下相溶解，并通过进样阀进样，根据检测器紫外光谱图进行收集，合并相同成分，得到木麻黄素单体109mg。
实施例3
取旌节花科植物的叶10kg，粉碎，用60%乙醇溶液超声波提取3次，减压回收乙醇得到浓缩液，用正丁醇萃取，萃取液回收正丁醇，再采用硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(5:4)洗脱，收集流分浓缩干燥得到粗提物。将乙酸乙酯-正丁醇-0.004M三氟乙酸(5：11：15)组成的溶剂系统在分液漏斗中充分振荡后静置，分层，上相为固定相，下相为流动相，使进样阀处于进样状态，将固定相以10ml/min的流速灌满逆流色谱仪的色谱分离柱，开启速度控制器，使螺旋管柱顺时针方向旋转，当色谱仪转速为850r/min时，以流速为2.5ml/min泵入流动相，将粗提物用下相溶解，并通过进样阀进样，根据检测器紫外光谱图进行收集，合并相同成分，得到木麻黄素单体928mg。
化学合成麻黄素 篇3：
麻黄素萃取新工艺
本发明涉及一种麻黄素萃取新工艺，属制药技术领域。
麻黄素是驰名中外的中草药，其药用的有效成分是生物碱，主要含于草麻黄和木贼麻黄中，其结构式为是一碱性化合物，故称之为麻黄碱。此生物碱主要由(一)麻黄碱和(+)伪麻黄碱组成。麻黄碱是拟肾上腺素药，临床用于支气管哮喘、过敏性反应、鼻粘膜肿胀以及低血压等病症的治疗，常用的药用麻黄素是其盐酸盐。目前盐酸麻黄素的生产流程如图1的工艺流程所示。在图1所示的麻黄草生产过程中均采用溶剂萃取法从麻黄草浸出液中提取麻黄碱，且萃取溶剂多采用甲苯或二甲苯。该萃取工艺的主要缺点是：①萃取收率偏低;②溶剂损失偏大;③溶剂有毒性。
本发明的目的是设计一种新的麻黄素萃取新工艺，用新的无毒萃取溶剂体系代替或部分代替现有溶剂，并提高萃取收率、降低溶剂消耗。
本发明设计的麻黄素萃取新工艺，由下列各步骤组成：
(1)取麻黄草浸出液，加NaOH溶液调PH至11.5—12。
(2)用由两种溶剂组成的复合溶剂对上述浸出液进行萃取，其中第一溶剂为6—8碳的脂肪醇中的任何一种，包括己醇、环己醇、庚醇和辛醇(正辛醇、异辛醇、仲辛醇)，第二溶剂为煤油(加氢煤油、磺化煤油)、高沸点的直链烷烃和芳烃中的任何一种，若不考虑毒性，也可采用甲苯、二甲苯作为第二溶剂，第一种溶剂和第二种溶剂之间的体积比为1∶0—10;两种溶剂可组成不同的排列组合。萃取操作温度为40—80℃，萃取流比有机相与水相体积比为0.6—1.2∶1。
(3)将上述萃得的有机相用浓度为5—10%的草酸水溶液进行反萃取，反萃温度为室温或稍高于室温，反萃后的有机溶剂碱洗后复用。
(4)对上述反萃液的水溶液经减压浓缩、结晶后，将(+)伪麻黄碱和草酸(一)麻黄碱分离，在草酸(一)麻黄碱中，按化学计量关系加入饱和CaCl2溶液作置换反应，对反应后的上清液进行脱色、浓缩、结晶，得盐酸(一)麻黄碱，即为麻黄素。
附图说明：
图1是已有技术工艺流程图。
表1为本发明的实施例。
表1：工艺实施例
序号 麻黄碱进料浓度 萃 取 体 系 苯 取 流 比(有机相与水相体积比) 萃取率% 1 0.15%20%异辛醇+80%二甲苯 0.8∶1 99.0% 2 0.1%30%异辛醇+70%加氢煤油 1∶1 99.5% 3 0.1%20%仲辛醇+80%二甲苯 1∶1 99.0% 4 0.08%30%仲辛醇+70%磺化煤油 0.6∶1 98.5% 5 0.06%20%正己醇+80%甲苯 0.8∶1 99.2% 6 0.06%10%异辛醇+90%甲苯 1.2∶1 98.0% 7 0.1%100%异辛醇 0.6∶1 99.0% 8 0.05%80%正己醇+20%二甲苯 0.6∶1 99.2% 9 0.05%60%正辛醇+40%磺化煤油 0.8∶1 99.6% 10 0.08%60%正庚醇+50%加氢煤油 0.9∶1 99.2% 11 0.08%40%仲辛醇+60%加氢煤油 0.8∶1 98.5% 12 0.08%100%仲辛醇 0.6∶1 99.1% 13 0.08%30%环己醇+70%煤油 1∶1 98.5%
化学合成麻黄素 篇4：
一种从茶叶末中提取分离木麻黄素的方法
第一、技术领域
本发明涉及茶萃出物，具体涉及从茶叶中分离茶多酚的方法。
第二、背景技术
茶多酚是茶叶的主要活性成分，是一类具有抗氧化、抗衰老和预防癌症等功效的酚类物质的总称。木麻黄素(Strictinin)是茶多酚中的一个具体化合物，其化学结构如下式Ⅰ所示。
木麻黄素具有很高的抗氧化能力，可以作为抗氧剂用于油脂类产品的抗氧化(Zhou,B.;Yang,L.;Liu,Z.-L.,Strictinin as an efficient antioxidant in lipid peroxidation.Chemistry and Physics of Lipids 2004,131,15-25.);在疾病治疗方面，研究表明木麻黄素具有抗病毒，尤其是抵抗流感病毒的作用(Saha,R.K.;Takahashi,T.;Kurebayashi,Y.;Fukushima,K.;Minami,A.;Kinbara,N.;Ichitani,M.;Sagesaka,Y.M.;Suzuki,T.,Antiviral effect of strictinin on influenza virus replication.Antiviral Research 2010,88,10-18.);因此，木麻黄素作为食品添加剂，在功能性食品开发中具有广阔的应用前景。
木麻黄素在茶叶中的含量很低，约占茶多酚总量的5%左右;因为受到茶叶中复杂成分的影响，目前除了硅胶柱层析和高效液相色谱法外，很难得到木麻黄素含量很高的茶多酚制品。但是上述方法存在对仪器设备要求高、产品成本高和难以进行规模化生产的不足，因此急需发展一种操作简便、可以进行规模化生产的分离方法。
公开号为CN 105330544A的专利申请公开了一种从茶叶末中提取分离5-O-没食子酰奎宁酸的方法，该方法采用对5-O-没食子酰奎宁酸具有特异性选择的磷酸锆为吸附剂，使用茶叶末为原料，在乙醇溶液中超声提取后，经过吸附、洗涤、脱附和冻干，不仅可制备较高纯度的5-O-没食子酰奎宁酸，且回收率较高。但是，该方法提取的茶多酚中，木麻黄素的纯度和回收率均较低。
第三、发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种从茶叶末中提取分离木麻黄素的方法，该方法具有木麻黄素回收率高和产品杂质低的优点。
本发明解决上述技术问题的方案是：
一种从茶叶末中提取分离木麻黄素的方法，该方法由以下步骤组成：
(1)取茶叶末，按1g∶10～20mL的固液比加入体积浓度为50～70%的乙醇溶液，超声提取，提取液经滤膜过滤，得到粗提液;
(2)按1mL粗提液加入0.3～0.5g磷酸锆的比例往粗提液中加入磷酸锆，摇床振荡12～24h，离心分离出液体，磷酸锆用水洗涤;其中，
所述的磷酸锆的理化参数如下：
晶胞参数为：
其红外光谱数据(KBr)为：3450，1632，1114，980，752，547(cm-1);
上述磷酸锆由以下方法制得：
A)取固体ZrOCl2·8H2O溶于去离子H2O后，在搅拌下缓慢滴加重量浓度为85%的磷酸溶液;得到的悬浊液继续反应3小时;
其中，ZrOCl2·8H2O、H3PO4和去离子H2O的摩尔比为ZrOCl2·8H2O∶H3PO4∶H2O=1∶2∶1000;
B)反应结束后，离心得到磷酸锆固体，用去离子水洗涤至pH=7，在烘箱中80℃烘干，再于马弗炉中500～1000℃煅烧1小时，即得白色磷酸锆;
(3)按0.1g∶1mL固液比往洗涤后的磷酸锆中加入重量浓度为0.4%的磷酸去离子水溶液，摇床振荡12h，离心分离得到脱附液，滤膜过滤，滤液冷冻干燥，即得木麻黄素。
本发明所述从茶叶末中提取分离木麻黄素的方法中，所述的超声提取的功率与物料体积比为2.5～5W∶1mL，超声提取的时间为50～70min。
本发明所述从茶叶末中提取分离木麻黄素的方法中，步骤(2)和(3)中所述的摇床震荡的工作温度37℃，转速为150rpm。
本发明所述方法针对木麻黄素的分子量、极性和化学结构，采用理化参数不同的磷酸锆为吸附剂对茶叶末的醇提物进行纯化，所得木麻黄素的纯度接近60%。本发明所述的方法除乙醇外，没有使用其他任何有机试剂，是一种环境友好型的分离方法。本发明方法操作简单、无需投入昂贵的生产设施、产品成本低，适于工业化生产。
第四、附图说明
图1为本发明所述方法制得的磷酸锆的IR图谱。
图2为本发明所述方法制得的磷酸锆的XRD图谱。
图3为本发明所述方法制得的木麻黄素的ESI-MS图谱。
图4为本发明所述方法制得的木麻黄素的NMR图谱。
图5为本发明所述方法制得的木麻黄素的HPLC图谱。
图6为本发明所述方法制得的茶叶粗提液的HPLC图谱。
图7为CN 105330544A中实施例6所述方法制得的磷酸锆的IR图谱。
图8为CN 105330544A中实施例6所述方法制得的磷酸锆的XRD图谱。
第五、具体实施方式
实施例1
一、磷酸锆的制备：
1、取1.79g固体ZrOCl2·8H2O溶于100mL的去离子H2O后，缓慢滴加0.76mL浓磷酸(85%wt)，得到的悬浊液在室温下连续搅拌3小时。
2、反应结束后，5000rpm离心得到的磷酸锆用去离子水洗涤至pH=7，在烘箱中80℃烘干12h，于马弗炉中900℃煅烧1小时，即得白色磷酸锆。
将制备的磷酸锆，溴化钾(KBr)压片后使用红外光谱(IR)进行分析，其红外光谱数据为：3450，1632，1114，980，752，547(cm-1)，相应的光谱图如附图1所示。
对制备的磷酸锆进行X射线衍射(XRD)分析，XRD衍射图如图2所示，计算得到的晶胞参数为：
二、木麻黄素的制备：
1、取过40目筛的茶叶末1g，加入体积浓度为70%的乙醇溶液10mL，在50W/45kHz下超声提取60min;提取液经0.45μm滤膜过滤后，得到粗提液。
2、向1mL粗提液中加入0.4g步骤一得到的磷酸锆，在37℃/150rpm的条件下，于震荡摇床上振荡吸附24小时;4000rpm离心1分钟，分离出的磷酸锆分别用10mL蒸馏水洗涤5次，得到洗涤后的磷酸锆。
3、按0.1g洗涤后的磷酸锆中加入1mL重量浓度为0.4%的磷酸去离子水溶液的比例往磷酸锆中加入磷酸去离子水溶液，在37℃/150rpm条件下，于震荡摇床上振荡脱附12小时;4000rpm离心1分钟后，得到的脱附液用0.22μm滤膜过滤，滤液经冷冻干燥后得到褐色固体7.38mg。
三、木麻黄素的鉴定：
将制备的褐色固体溶于0.1%的甲酸溶液后，液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS)后，其MS图谱如图3所示，测得褐色固体中主要成分的荷质比(m/z)[M-H]为633.1，结合已有文献(Zhao,Y.;Chen,P.;Lin,L.;Harnly,J.M.;Yu,L.;Li,Z.,Tentative identification,quantitation,and principal component analysis of green pu-erh,green,and white teas using UPLC/DAD/MS.Food Chem 2011,126,1269-1277.)，初步确定其结构为木麻黄素。
为进一步确定其结构，使用制备HPLC对所得茶多酚中的主要成分进行分离，得到纯度大于95%的白色固体目标化合物，该白色固体溶于氘代丙酮后，对其进行NMR分析，其NMR图谱如图4所示，结果如下：1H NMR(300MHz,丙酮):δ7.21(d,2H),6.71(s,1H),6.59(s,1H),5.75(s,1H),5.21(d,1H),5.21(s,1H),4.90(s,1H),4.12(s,1H),3.82(s,1H),3.79(s,1H),3.71(s,1H)，该图谱与文献(Michihata,N.;Kaneko,Y.;Kasai,Y.;Tanigawa,K.;Hirokane,T.;Higasa,S.;Yamada,H.,High-Yield Total Synthesis of(-)-Strictinin through Intramolecular Coupling of Gallates.The Journal of Organic Chemistry 2013,78,4319-4328.)对木麻黄素的报道一致。结合文献中对木麻黄素的报道，及其MS和NMR结果，确定本实验分离得到茶多酚中主要成分为木麻黄素。
四、木麻黄素及茶叶粗提液中木麻黄素含量检测：
以本实施例制备的褐色固体茶多酚为样品、以武汉天植生物技术有限公司生产的木麻黄素为标准品，分别溶于0.4%的磷酸水溶液后，使用高效液相色谱对其纯度进行分析，其HPLC图谱如图5所示。色谱条件为：流动相A为乙腈;流动相B为0.4%的磷酸/蒸馏水溶液;0～14分钟，流动相A由5%的梯度增加到15%，14～25分钟，流动相A保持15%梯度不变，25～53分钟，流动相A由15%的梯度增加到35%，53～65分钟，流动相A由35%梯度增加到85%;检测波长为270nm，流速为0.7mL/min。
茶叶粗提液使用相同HPLC方法测定，其HPLC图谱如图6所示。
结果表明：本实施例中，磷酸锆分离得到的茶多酚中木麻黄素的HPLC纯度为57.39%，回收率73.07%。
木麻黄素的回收率按以下公式计算：
回收率(%)=(磷酸锆分离得到茶多酚质量×木麻黄素的HPLC含量)/磷酸锆吸附的木麻黄素的质量×100%(1)
其中，磷酸锆吸附的木麻黄素的质量由以下标准曲线(标准品与其色谱峰面积作图)计算：
磷酸锆吸附的木麻黄素的质量(mg)=(粗提液中木麻黄素的色谱峰面积-吸附液后上清液中木麻黄素峰面积)/(8×109)(R2=0.998)(2)
实施例2
一、磷酸锆的制备：
本实施例中磷酸锆制备方法与实施例1相同。
二、木麻黄素的制备：
1、取过40目筛的茶叶末1g，加入体积浓度为50%的乙醇溶液10mL，在50W/45kHz下超声提取60min;提取液经0.45μm滤膜过滤后，得到粗提液。
2、向1mL粗提液中加入0.3g步骤一得到的磷酸锆，在37℃/150rpm的条件下，于震荡摇床上振荡吸附24小时;4000rpm离心1分钟，分离出的磷酸锆分别用10mL蒸馏水洗涤5次，得到洗涤后的磷酸锆。
3、按0.1g洗涤后的磷酸锆中加入1mL重量浓度为0.4%的磷酸去离子水溶液的比例往磷酸锆中加入磷酸去离子水溶液，在37℃/150rpm条件下，于震荡摇床上振荡脱附12小时;4000rpm离心1分钟后，得到的脱附液用0.22μm滤膜过滤，滤液经冷冻干燥后得到褐色固体4.88mg。
采用实施例1同样的方法进行鉴定和纯度检测，结果表明本实施例中磷酸锆分离得到的茶多酚中，木麻黄素的HPLC纯度为55.21%，回收率68.76%。
实施例3
一、磷酸锆的制备：
本实施例中磷酸锆制备方法与实施例1的不同之处在于：磷酸锆煅烧温度为700度，其余操作步骤和参数与实施例1相同。
二、木麻黄素的制备：
1、取过40目筛的茶叶末1g，加入体积浓度为70%的乙醇溶液20mL，在50W/45kHz下超声提取70min;提取液经0.45μm滤膜过滤后，得到粗提液。
2、向1mL粗提液中加入0.3g步骤一得到的磷酸锆，在37℃/150rpm的条件下，于震荡摇床上振荡吸附12小时;4000rpm离心1分钟，分离出的磷酸锆分别用10mL蒸馏水洗涤5次，得到洗涤后的磷酸锆。
3、按0.1g洗涤后的磷酸锆中加入1mL重量浓度为0.4%的磷酸去离子水溶液的比例往磷酸锆中加入磷酸去离子水溶液，在37℃/150rpm条件下，于震荡摇床上振荡脱附12小时;4000rpm离心1分钟后，得到的脱附液用0.22μm滤膜过滤，滤液经冷冻干燥后得到褐色固体3.09mg。
采用实施例1同样的方法进行鉴定和纯度检测，结果显示本实施例中磷酸锆分离得到的茶多酚中，木麻黄素的HPLC纯度为52.88%，回收率67.21%。
实施例4
一、磷酸锆的制备：
本实施例中磷酸锆制备方法与实施例1相同。
二、木麻黄素的制备：
1、取过40目筛的茶叶末1g，加入体积浓度为70%的乙醇溶液10mL，在50W/45kHz下超声提取70min;提取液经0.45μm滤膜过滤后，得到粗提液。
2、向1mL粗提液中加入0.3g步骤一得到的磷酸锆，在37℃/150rpm的条件下，于震荡摇床上振荡吸附12小时;4000rpm离心1分钟，分离出的磷酸锆分别用10mL蒸馏水洗涤5次，得到洗涤后的磷酸锆。
3、按0.1g洗涤后的磷酸锆中加入1mL重量浓度为0.4%的磷酸去离子水溶液的比例往磷酸锆中加入磷酸去离子水溶液，在37℃/150rpm条件下，于震荡摇床上振荡脱附12小时;4000rpm离心1分钟后，得到的脱附液用0.22μm滤膜过滤，滤液经冷冻干燥后得到褐色固体5.12mg。
采用实施例1同样的方法进行鉴定和纯度检测，结果表明本实施例中磷酸锆分离所得茶多酚中，木麻黄素的HPLC纯度为61.84%，回收率66.02%。
实施例5
一、磷酸锆的制备：
本实施例中磷酸锆制备方法与实施例1相同。
二、木麻黄素的制备：
1、取过40目筛的茶叶末1g，加入体积浓度为50%的乙醇溶液20mL，在50W/45kHz下超声提取50min;提取液经0.45μm滤膜过滤后，得到粗提液。
2、向1mL粗提液加入0.3g磷酸锆的比例往粗提液中加入步骤一得到的磷酸锆，在37℃/150rpm的条件下，于震荡摇床上振荡吸附12小时;4000rpm离心1分钟，分离出的磷酸锆分别用10mL蒸馏水洗涤5次，得到洗涤后的磷酸锆。
3、按0.1g洗涤后的磷酸锆中加入1mL重量浓度为0.4%的磷酸去离子水溶液的比例往磷酸锆中加入磷酸去离子水溶液，在37℃/150rpm条件下，于震荡摇床上振荡脱附12小时;4000rpm离心1分钟后，得到的脱附液用0.22μm滤膜过滤，滤液经冷冻干燥后得到褐色固体2.21mg。
采用实施例1同样的方法进行鉴定和纯度检测，结果显示本实施例中磷酸锆分离所得到的茶多酚中，木麻黄素的HPLC纯度为51.08%，回收率67.46%。
实施例6
一、磷酸锆的制备：
本实施例中磷酸锆制备方法与实施例1的不同之处在于：磷酸锆煅烧温度为700度，其余操作步骤和参数与实施例1相同。
二、木麻黄素的制备：
1、取过40目筛的茶叶末1g，加入体积浓度为70%的乙醇溶液20mL，在50W/45kHz下超声提取60min;提取液经0.45μm滤膜过滤后，得到粗提液。
2、向1mL粗提液中加入0.5g步骤一得到的磷酸锆，在37℃/150rpm的条件下，于震荡摇床上振荡吸附24小时;4000rpm离心1分钟，分离出的磷酸锆分别用10mL蒸馏水洗涤5次，得到洗涤后的磷酸锆。
3、按0.1g洗涤后的磷酸锆中加入1mL重量浓度为0.4%的磷酸去离子水溶液的比例往磷酸锆中加入磷酸去离子水溶液，在37℃/150rpm条件下，于震荡摇床上振荡脱附12小时;4000rpm离心1分钟后，得到的脱附液用0.22μm滤膜过滤，滤液经冷冻干燥后得到褐色固体4.86mg。
采用实施例1同样的方法进行鉴定和纯度检测，结果显示本实施例中磷酸锆分离所得到的茶多酚中，木麻黄素的HPLC纯度为51.64%，回收率63.58%。
实施例7(对比例)
公开号为CN 105330544A的专利申请公开了一种从茶叶末中提取分离5-O-没食子酰奎宁酸的方法，该方法也是选择磷酸锆为特异选择性吸附剂，使用茶叶末为原料，在乙醇溶液中超声提取后，经过吸附、洗涤、脱附和冻干，不仅可制备较高纯度的5-O-没食子酰奎宁酸，且回收率较高。
本实施例使用公开号为CN 105330544A的专利申请所述的方法从茶叶末中提取分离木麻黄素，并对所得木麻黄素的纯度和回收率进行检测，以比较两种方法对提取分离木麻黄素的优劣。
一、样品木麻黄素：
为本发明实施例1～6所制备的，按实施例依次为样品1～6。
二、对照品木麻黄素的制备：
1、磷酸锆的制备
由公开号为CN 105330544A专利申请的6个实施例可见，其中实施例6的磷酸锆效果最好。公开号为CN 105330544A的专利申请的实施例6的磷酸锆具体制备方法如下：
(1)取3.58g固体ZrOCl2·8H2O溶于200mL的去离子水后，加入7.56g固体(NH4)2CO3，连续搅拌至溶液澄清;再加入2.94g的(NH4)2HPO4，完全溶解后加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)1.01g，得到澄清反应液。
(2)将该澄清反应液转移到不锈钢反应釜中，加热至80℃反应2天，90℃反应1天，120℃反应1天;反应结束后，冷却反应釜至常温，5000rpm离心得到的磷酸锆固体用去离子水洗涤至pH=7，在烘箱中80℃烘干12h，于马弗炉中550℃煅烧6小时，即得白色磷酸锆。
对CN 105330544A实施例6的磷酸锆同样进行红外光谱和X射线衍射分析，结果如下：
红外光谱数据(KBr)为：3450，1650，1032，520(cm-1)，其光谱图如附图7所示。
XRD衍射图如附图8所示，表明磷酸锆没有典型的晶体结构，属于一种非晶结构。
2、制备对照品木麻黄素：
具体制备方法分别参照本发明实施例1～6所述和公开号为CN 105330544A的专利申请的实施例1～6步骤二所述的方法制备木麻黄素，其中，按本发明实施例1～6所述方法制备的木麻黄素依次对应为对照品1～6;按公开号为CN 105330544A的专利申请的实施例1～6所述方法制备的木麻黄素依次对应为对照品7～12。
三、实验结果：
按本发明实施例1步骤四所述方法分别检测对照品1～12中的木麻黄素纯度和回收率，具体结果如表1所示。
表1样品和对照品茶多酚中木麻黄素的重量、纯度及其回收率
由表1可见，样品1～6的纯度和回收率均显著高于对照品1～12，说明使用本发明所述的磷酸锆提取分离木麻黄素的方法好于现有技术。
化学合成麻黄素 篇5：
对麻黄素组织损伤修复的中药组合物及其生产工艺
第一、技术领域
本发明涉及一种中药组合物，尤其涉及一种对麻黄素组织损伤修复，即抗麻黄素损伤的戒毒的中药组合物及其生产工艺。
第二、背景技术
兴奋剂滥用是当今世界严重的社会问题和医学问题，研究中草药对兴奋剂成瘾动物的戒断或脱毒作用，研发新的无毒副作用和具有戒断作用的中药制剂，对于医学事业的发展和禁吸戒毒、维护社会安定都有重要意义。
麻黄素亦称麻黄碱，属于生物碱类，是拟交感神经药，临床主治支气管哮喘、感冒、过敏反应、鼻粘膜充血、水肿及低血压等疾病。麻黄素亦是中枢兴奋药，可引起精神欣快感，产生性激动及幻觉，应用过量或滥用易引起心脏及中枢神经系统毒副作用，产生对药物的依赖性，导致精神障碍和行为异常，严重时会引起死亡。“冰毒”即兴奋剂甲基苯丙胺(去氧麻黄碱)，可由苯丙胺经甲基化合成，也可由麻黄素经脱氧处理得到，制毒分子用麻黄素制冰毒，进而再生产出摇头丸等毒品，吸食冰毒(去氧麻黄碱)可引起疾病甚至死亡，鼠脑细胞与甲基苯丙胺(去氧麻黄碱)接触后可促进细胞凋亡，麻黄素可致组织细胞抗氧化物酶活力下降和组织细胞损伤。目前还没有特殊疗效的抗麻黄素损伤的戒毒药物。
第三、发明内容
本发明目的之一提供一种对麻黄素组织损伤修复的中药组合物(抗麻黄素损伤的戒毒药物)。以达到抗麻黄素损伤，促进组织细胞修复，消除麻黄素成瘾后的心理因素而彻底戒断毒瘾的目的。
目的之二提供一种该中药组合物水剂的制备方法。
所采用的技术方案为：
一种对麻黄素组织损伤修复的中药组合物，采用以下重量比配方：
黄芪40-50%，川芎35-45%，甘草10-20%。
进一步地，对麻黄素组织损伤修复的中药组合物的配方优选：
黄芪45%，川芎40%，甘草15%。
一种对麻黄素组织损伤修复的中药组合物的水剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)分别取等量的黄芪、川芎、甘草，各加水5倍量，浸泡1小时，煎煮30分钟，滤出药液备用，药渣再各加水5倍量，煎煮30分钟，滤出药液备用;
(2)取步骤(1)两次药液，分别合并后浓缩定容至250 mL，制成浓缩液;
(3)取步骤(2)各浓缩液，按所述配方比例合并即可。
本发明主要利用黄芪益气补肾、利尿脱毒、提高免疫功能、增强抗氧化、抗癌、抗衰老和防护DNA 损伤作用，川芎行气活血、祛瘀止痛的功效，甘草清热解毒、缓急止痛、调和诸药之功效，提高组织细胞活性，抑制细胞凋亡，减缓组织细胞损伤，促进组织损伤修复，治疗戒断症状和消除残毒。长期吸吮麻黄素成瘾的患者，机体器官组织受损，身体比较虚弱，生理依赖和心理依赖，在短期内无法消除，本发明可作为强制戒断，以减缓组织细胞损伤，促进组织细胞修复，有效地消除生理依赖和心理依赖而治疗或戒断麻黄素毒瘾。
另外，吸毒者经过一段时间的治疗，戒毒者就可以摆脱身体对兴奋剂的依赖，但一些症状还可能会继续停留一段时间，如失眠、烦躁、焦虑、全身疼痛、精神抑郁等戒断反应，这些稽延症状还可能长达数个月甚至更长时间，十分容易造成脱毒者复吸，本发明对麻黄素组织损伤修复的药物，可作为维持治疗，可有效地抑制复吸，清除戒断后稽延性症状。
本发明不含依赖性药物和任何麻醉剂，亦没有任何合成物质，属纯中药制剂，具有益气补肾、行气活血、祛瘀止痛、利尿脱毒、抗氧化、抗衰老之功效，适用于注射麻黄素等毒品成瘾者或吸吮者的脱毒治疗和脱毒后的维持治疗。
本发明在生产制备过程中，工艺简单，无污染，投资少，药物价廉，取材方便。具有疗效高，无毒副作用，服用方便等特点，适宜专业戒毒所、疗养院、医院及家庭使用。
第四、具体实施方式
实施例1，一种对麻黄素组织损伤修复的中药组合物，主要包括以下重量比的组分：黄芪45%，川芎40%，甘草15%。
实施例2，一种对麻黄素组织损伤修复的中药组合物，主要包括以下重量比的组分：黄芪40%，川芎45%，甘草15%。
实施例3，一种对麻黄素组织损伤修复的中药组合物，主要包括以下重量比的组分：黄芪50%，川芎40%，甘草10%。
实施例4，一种对麻黄素组织损伤修复的中药组合物，主要包括以下重量比的组分：黄芪42%，川芎42%，甘草16%。
实施例5，一种对麻黄素组织损伤修复的中药组合物，主要包括以下重量比的组分：黄芪48%，川芎38%，甘草14%。
实施例6，一种对麻黄素组织损伤修复的中药组合物，主要包括以下重量比的组分：黄芪45%，川芎35%，甘草20%。
本发明可制成水剂或胶囊剂。
一种对麻黄素组织损伤修复的中药组合物的水剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)分别取等量的黄芪、川芎、甘草，各加水5倍量，浸泡1小时，煎煮30分钟，滤出药液备用，药渣再各加水5倍量，煎煮30分钟，滤出药液备用;
(2)取步骤(1)两次药液，分别合并后浓缩定容至250 mL，制成浓缩液;
(3)取步骤(2)各浓缩液，按所述配比混合即可。
本发明胶囊剂的制备方法：将所述中药组合物晒干或烘干，经机械粉碎过筛，按所述配比均匀混合后用胶囊盛装。
本发明的动物实验如下：
药液制备
分别取黄芪、川芎、甘草中草药500 g，各加水5倍量，浸泡1 h，煎煮30 min，滤出药液备用，药渣再加水5倍量，煎煮30 min，滤出药液备用。将两次药液合并后浓缩定容至250 mL，制成浓缩液;各浓缩液按黄芪45%，川芎40%，甘草15%比例合并备用。
模型建立与给药
选出生3-5天的昆明小鼠72只(体重4 ~ 5 g，兰州大学实验动物中心提供)，实验前适应性饲养一周，然后随机分为3组，对照组、模型组和中药组(每组24只)。模型组和中药组动物先用递增剂量腹腔连续注射麻黄素15 d，建立麻黄素依赖小鼠成瘾模型(在1-5，6-10，11-15 d分别注射0.2 mL 浓度为2.0，3.0，4.0 mg/mL的麻黄素溶液，每天(9:00am，16:00pm)两次，对照组每天注射等体积的生理盐水);建模后，中药组用递增剂量灌胃中药进行戒断(在建模后1-5，6-10，11-15 d分别灌胃0.2，0.3，0.4 mL的中药，每天两次)，对照组和模型组灌胃等量的生理盐水。
酶活性测定
实验动物给药后，分别于戒断5，10，15 d，即刻经眼眶后静脉丛采血1-2 mL，随后断头处死，取血液室温放置1 h，2500 r/ min离心(10 min)，分离制备血清。同时，迅速切取肾脏组织，在预冷的生理盐水中漂洗，滤纸吸干，精确称重后，滴加肾组织重量9倍的生理盐水，入匀浆器中在冰水中匀浆(5 min)，以3000 r/min离心(10 min)，分离出上清液。用微量移液器吸取血清或上清液，按照超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)试剂盒的操作要求(试剂盒购于南京建成生物工程研究所)，用 UV-VIS spectrophotometer(U-1800型 Tokyo Japan)全自动分光光度计分别在550，240，532，640，510 nm波长处检测SOD，CAT活力和MDA，BUN，SCr的含量。
组织学观察
分别在给药戒断5，10，15 d取小鼠肾组织数块，用预冷的生理盐水冲洗干净，投入10%的中性福尔马林液中固定24 h，常规石蜡包埋、连续切片(6μm)，H.E染色，在光学显微镜(Olympus，FX-35WA，Japan)下观察并摄片。
免疫组织化学
将肾组织石蜡切片脱蜡至水，微波处理进行抗原修复，3% H2O2孵育消除内源性过氧化酶活性，正常山羊(Capra genus)血清室温孵育(30min)以封闭非特异性反应位点，一抗用兔抗Bax蛋白和兔抗转化生长因子(TGF-β1)(工作浓度为1∶200)，置4℃冰箱孵育过夜;滴加生物素标记的二抗(羊抗兔IgG抗血清)，室温孵育(30 min);滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物工作液，室温孵育(30 min);空白对照用PBS代替一抗，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封片，光镜观察并拍照(Bax蛋白和TGF-β1，SABC免疫组化试剂盒和DAB显色剂购自武汉博士德公司)。
面密度值测量
用固定好的肾组织数块，定向包埋后连续切片(6μm)，每个蜡带贴1张，共10张，每张切片随机选择12个视野观察、摄片(×400)。采用方格测试系统，交点计数法分别测算凋亡细胞和阳性表达细胞的面密度值。
统计学分析
用 SPSS 13.0软件进行统计学分析处理，数据用表示，各组间均数比较采用双尾t检验，P<0.05表示差异显著，P<0.0l为差异极显著。
实验结果(表1~7)
表1 各发育期小鼠血BUN含量的变化
与对照组比较** P < 0.01;与模型组比较#P < 0.05，##P < 0.01(下同)。
表2 各发育期小鼠血Cr含量的变化
表3 各发育期小鼠肾MDA含量的变化
表4 各发育期小鼠肾SOD活力的变化
表5 各发育期小鼠肾CAT活力的变化
表6 Bax蛋白在小鼠肾组织表达的面密度值
表7 TGF-β1在小鼠肾组织表达的面密度值
综合上述，本发明经对麻黄素成瘾动物试验，明显降低麻黄素成瘾动物血中尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)含量及组织丙二醛(MDA)含量(P<0.05或P<0.01)(表1，2，3)，显著提升组织细胞中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性(P<0.05或P<0.01)(表4，5)，明显减轻组织细胞变性，降低组织细胞Bax蛋白和TGF-β1的阳性表达强度(表6，7)。且使用安全，无依赖性，无明显毒副作用。
