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牛血清白蛋白 (内容集合7篇)

2020-09-01 17:09:24

  牛血清白蛋白 篇1:

  一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法

  第一、技术领域

  本发明属于蛋白质纯化领域,具体涉及一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法。

  第二、背景技术

  核酸酶是一种能催化核苷酸链(DNA和RNA)中磷酸二酯键水解的酶,作用于磷酸二酯键的P-O位置,广泛存在于动植物体内及空气中。不同来源的核酸酶,其专一性、作用方式都有所不同。只能作用于RNA的称为核糖核酸酶(RNase),只能作用于DNA的称为脱氧核糖核酸酶(DNase),有些核酸酶既能作用于RNA也能作用于DNA,因此统称为核酸酶(nuclease)。根据核酸酶作用位置的不同,可将核酸酶分为核酸外切酶(exonuclease)和核酸内切酶。

  由于核酸酶具有很强的降解核酸(DNA及RNA)的能力,因此在以核酸为模板的检测中,由于存在核酸酶污染很容易出现假阴性结果。另外,核酸酶的耐热性较好,尤其是RNase酶,即使经过高温处理也仍可能有残留的活性。通常PCR检测过程中,对所用水、液体试剂等的灭活主要采用DEPC(剧毒)水浸泡灭活处理,并且之后必须进行高温高压降解DEPC处理。牛血清白蛋白(BSA)是一种常用的PCR扩增增强剂和稳定剂,它能够起到稳定扩增酶、降低PCR抑制物的作用,减少扩增酶蛋白对容器的吸附等作用。由于BSA生物来源的属性,必然会残留一定量的核酸酶;为了避免其蛋白变性,又不能采用剧烈条件对核酸酶进行灭活处理。因此需要一种更有效的去除BSA中核酸酶的方法,以提高BSA在核酸检测,如PCR检测中的效果。

  硅藻土具有密度小、比表面积大、多孔、吸附性强、耐酸、耐碱、熔点高等特点,主要性质如下:(1)硅藻土表面有大量不同种类的羟基,硅藻土中的羟基与其吸附性能直接相关,羟基越多,则吸附性能越好。硅藻土中的羟基在热处理条件下可以发生转化,改变硅藻土的吸附性能。此外,这些羟基具有活性,能与其他物质发生反应,改变硅藻土的吸附特性;(2)硅藻土表面的电荷一般为负电荷,使得硅藻土颗粒表现出一定的负电性,在大多数pH值范围内硅藻土表面都带负电,能与其他一些带正电荷的蛋白质结合,进而实现对蛋白质的纯化作用。

  由于其廉价、吸附性强、化学性质稳定等特性,硅藻土已经被广泛应用许多领域。淳俊等人利用硅藻土能有效吸附RNA酶这一特性,开发了一种广泛适用的RNA提取方法。结果表明采用硅藻土-苯酚提取方法提取RNA的得率是异硫氰酸胍法的3倍多,而且使用范围较广。但是没有对提取的RNA样品中残留的核酸酶进行测试。翟玲等人报道了一种去除牛血清白蛋白蛋白中的RNA酶的方法,采用高岭土对牛血清白蛋白溶液进行吸附,通过电泳法进行检测,结果表明,37℃条件下未经高岭土处理的BSA在1个小时内没有表现出RNA酶活性,但2小时后表现出明显的RNA酶的活性,而经过高岭土处理的BSA在2小时内几乎不水解RNA,但该检验方法为电泳法,灵敏度相对较低,微量残留的核酸酶检测不到。

  肝素(Heparin)是一种含硫酸脂的酸性多糖,能和抗凝血因子Ⅲ、凝血酶、类凝血酶、人凝血因子、DNA结合,进而实现对这些物质的纯化。核酸酶是一类能和DNA或RNA相互结合的蛋白,因而可以用肝素对核酸酶进行纯化或去除。匡春香等人利用Heparin-separinCL-6B结合DEAE-Sephades A-25对BSA进行RNA核酸酶的去除,采用λ-HindⅢDNA片段,pBR322DNA,16S,23S rRNA为底物,加入不同浓度经过纯化的BSA样品于37℃条件下反应4h。结果发现电泳图谱与空白相比没有明显变化,作者认为已经分子生物学级要求,但电泳法本身灵敏度不高,有微量的核酸酶残留也检测不出来。另外电泳法是一个开放的体系,容易对环境造成核酸污染。本发明采用荧光定量PCR方法来检测核酸酶的残留,灵敏度要高于电泳法,而且是不开盖体系,不会造成核酸污染,即使微量的核酸酶残留也能在CT值上体现出来。

  目前有单独使用硅藻土(高岭土)或肝素结合DEAE去除核酸酶的报道,用电泳检测方法未检测到有明显的变化,但本发明采用荧光定量PCR方法检测核酸酶残留量时发现单独采用硅藻土或肝素对牛血清白蛋白处理后仍有核酸酶残留,造成实验的CT值推后,检测灵敏度下降,定量不准确。为了解决单独硅藻土或肝素去除BSA中的核酸酶不完全这一难题,开发了硅藻土结合肝素来进行核酸酶去除的方法,该方法成本低,操作简单、快速,适合于工业化生产。另外,分子生物学级别的BSA价格非常昂贵,应用面广,因此本发明产生的经济效益极为显著。

  第三、发明内容

  针对现有技术的不足,本发明的目的是提供一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法。本发明的方法结合硅藻土和肝素两种方法对牛血清白蛋白进行精细纯化,能够制备分子生物级的牛血清白蛋白。另外,本发明的整个方法过程温和,无需高温、高压及DEPC浸泡,最大限度的保持了牛血清白蛋白活性,同时也避免了对环境的污染。

  本发明是通过以下技术方案实现的:

  一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法,包括以下步骤:

  (1)吸附剂用悬浮液重悬并洗涤3次后,在悬浮液中分散均匀,得到吸附剂分散液,在4℃条件下储存备用;

  (2)将牛血清白蛋白样品溶解在悬浮液中形成样品分散液,然后加入吸附剂分散液,搅拌后分离并收集上清液;

  (3)将上清液与吸附剂分散液混合,搅拌后分离并收集上清液,重复两次;将收集的上清液用膜过滤后,得到牛血清白蛋白纯化液1;

  (4)用肝素-琼脂糖(Heparin-Sepharose)层析柱对步骤(3)得到的牛血清白蛋白纯化液1进行纯化,收集穿透峰,得到牛血清白蛋白纯化液2;

  (5)采用分子截留量为10KD的超滤浓缩管对牛血清白蛋白纯化液2进行超滤浓缩,得到超滤牛血清白蛋白样品3;

  (6)将超滤牛血清白蛋白样品3采用分子截留量为14000Da的透析袋4℃条件下搅拌透析2-3h后,更换透析液透析过夜,即得分子生物级牛血清白蛋白。

  优选地,所述吸附剂、悬浮液在使用前经过灭菌处理。

  优选地,所述吸附剂是具有多孔结构的吸附性材料。

  进一步优选地,所述吸附剂为硅藻土或高岭土。

  优选地,所述悬浮液是Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲溶液中的一种或多种,浓度为10mM-100mM,pH为5-9。

  进一步优选地,所述悬浮液的浓度为40-60mM,pH为7.5-8.5。

  进一步优选地,所述悬浮液为Tris-HCl缓冲溶液,浓度为50mM,pH为7.8.

  优选地,步骤(1)中吸附剂与悬浮液的比例为1:1-1:20w/v。

  优选地,步骤(2)中牛血清白蛋白样品与悬浮液的比例为1:1-1:10w/v;样品分散液与吸附剂分散液的体积比1:1-1:10。

  优选地,步骤(3)中每次使用的吸附剂分散液的体积与步骤(2)中使用的吸附剂分散液的体积相同。

  优选地,所述搅拌在4℃进行30min,所述分离是在10000rpm离心10min。

  优选地,肝素-琼脂糖(Heparin-Sepharose)层析柱使用前用平衡液进行平衡,所述平衡液为Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲溶液中的一种或多种,浓度为10mM-100mM,pH为5-9。

  进一步优选地,所述平衡液为Tris-HCl缓冲溶液,浓度为10mM-50mM,pH为7-9。

  进一步优选地,所述平衡液为Tris-HCl缓冲溶液,浓度为20mM,pH为8。

  优选地,透析使用的透析液为Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲溶液中的一种或多种,浓度为10mM-100mM,pH为5-9。

  进一步优选地,透析液为Tris-HCl缓冲溶液,浓度为10mM-50mM,pH为7-9。

  进一步优选地,透析液为Tris-HCl缓冲溶液,浓度为10mM,pH为8。

  优选地,超滤牛血清白蛋白样品3与透析液的体积比为1:10-1:20。

  本发明的有益效果:

  (1)本发明的方法采用硅藻土与Heparin-sepharose层析柱的结合对牛血清白蛋白样品进行纯化,能够去除牛血清白蛋白样品中的核酸酶,得到分子生物级的牛血清白蛋白;

  (2)本发明的方法的整个纯化过程都在低温环境下进行,最大限度的保持了牛血清白蛋白的活性;并且不涉及DEPC处理,不会对环境造成污染;

  (3)本发明的方法仅需一步吸附、一步柱层析即可完全去除牛血清白蛋白中微量的核酸酶,省时省力且回收效率高,便于放大规模;

  (4)与未经处理的牛血清白蛋白相比,在核酸检测体系中使用本发明的方法制备的牛血清白蛋白时,检测灵敏度明显提高,对于临床中的病原核酸检验具有重要意义。

  第四、附图说明

  图1是DNA样品检测中不同牛血清白蛋白样品扩增Ct值变化的图;

  图2是RNA样品检测中不同牛血清白蛋白样品扩增Ct值变化的图;

  其中×表示未经过处理的BSA样品;▲表示单独硅藻土纯化的BSA样品;■表示单独Heparin-Sepharose层析柱纯化的BSA样品;●表示硅藻土结合Heparin-Sepharos层析柱纯化的BSA样品。

  第五、具体实施方式

  本发明的方法采用硅藻土与Heparin-Sepharose层析柱的结合来去除牛血清白蛋白中微量的核酸酶,本领域的技术人员可以参考本发明的内容对方法参数进行适当地修改,而这些修改也应被视为包括在本发明内。

  为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案,以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例中未注明具体条件的,按照常规条件或制造商的建议条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市面购到的常规产品。

  实施例1单独使用硅藻土纯化牛血清白蛋白

  用硅藻土纯化牛血清白蛋白(去除牛血清白蛋白中的核酸酶)时,使用的悬浮液为Tris-HCl缓冲溶液,浓度为50mM,pH为7.8;使用的透析液为Tris-HCl缓冲溶液,浓度为10mM,pH为8.0;硅藻土以及悬浮液使用前在121℃条件下灭菌30min。具体的纯化步骤为:

  (1)将6g硅藻土用60mL悬浮液(硅藻土与悬浮液的比例为1:10w/v)混合,置于100℃沸水浴中5min,室温条件下搅拌5min,5000rpm离心10min,丢弃上清液;重复上述洗涤步骤3次后,将洗涤后的硅藻土在60mL悬浮液中分散均匀,得到吸附剂分散液,在4℃条件下储存备用;

  (2)将2.5g牛血清白蛋白在12.5mL悬浮液中(牛血清白蛋白与悬浮液的比例为1:5w/v)溶解分散均匀,加入18.75mL吸附剂分散液,在4℃搅拌30min后,在该温度下10000rpm离心10min,收集上清;

  (3)在上清液中加入18.75mL吸附剂分散液(牛血清白蛋白悬浮液与吸附剂分散液的比例为1:1.5v/v),在4℃搅拌30min,在该温度10000rpm离心10min,收集上清液;再重复一次;

  (4)收集的上清用0.45μm膜过滤后,即得牛血清白蛋白纯化液;

  (5)采用分子截留量为10KD的超滤浓缩管2500rpm离心20min,对蛋白浓度进行超滤浓缩,得到超滤牛血清白蛋白样品;

  (6)将超滤牛血清白蛋白样品采用分子截留量为14000Da的透析袋4℃条件下搅拌透析2h后,更换透析液透析过夜,超滤牛血清白蛋白样品与透析液的体积比为1:15;

  (7)透析后的样品测定蛋白浓度后,稀释至10mg/ml,分装成1mL/支,保存于-20℃。

  实施例2单独使用Heparin-Sepharose层析柱纯化牛血清白蛋白

  用Heparin-Sepharose层析柱纯化牛血清白蛋白(去除牛血清白蛋白中的核酸酶)时,使用的层析柱平衡液为Tris-HCl缓冲溶液,浓度为20mM,pH为8.0;使用的透析液为Tris-HCl缓冲溶液,浓度为10mM,pH为8.0;平衡液使用前在121℃条件下灭菌30min。具体的纯化步骤为:

  (1)将2.5g牛血清白蛋白在12.5mL平衡液中分散均匀,用0.45μm膜过滤后,作为上样样品;

  (2)用平衡液平衡Heparin-Sepharose层析柱5倍CV,流速为180mL/h后,对上样样品进行纯化,收集穿透峰,上样完成后用平衡液洗脱至基线平稳;

  (3)采用分子截留量为10KD的超滤浓缩管2500rpm离心20min,对收集的穿透峰进行超滤浓缩,得到超滤牛血清白蛋白样品;

  (4)将超滤牛血清白蛋白样品采用分子截留量为14000Da的透析袋4℃条件下搅拌透析2h后,更换透析液透析过夜,超滤牛血清白蛋白样品2与透析液的体积比为1:15;

  (5)透析后的样品测定蛋白浓度后,稀释至10mg/ml,分装成1mL/支,保存于-20℃。

  实施例3使用硅藻土与Heparin-Sepharose层析柱的结合纯化牛血清白蛋白

  用硅藻土与Heparin-Sepharose层析柱的结合纯化牛血清白蛋白(去除牛血清白蛋白中的核酸酶)时,使用的悬浮液为Tris-HCl缓冲溶液,浓度为50mM,pH为7.8;使用的层析柱平衡液为Tris-HCl缓冲溶液,浓度为20mM,pH为8.0;使用的透析液为Tris-HCl缓冲溶液,浓度为10mM,pH为8.0;硅藻土、悬浮液以及平衡液使用前在121℃条件下灭菌30min。具体的纯化步骤为:

  (1)将6g硅藻土用60mL悬浮液(硅藻土与悬浮液的比例为1:10w/v)混合,置于100℃沸水浴中5min,室温条件下搅拌5min,5000rpm离心10min,丢弃上清液;重复上述洗涤步骤3次后,将洗涤后的硅藻土在60mL悬浮液中分散均匀,得到吸附剂分散液,在4℃条件下储存备用;

  (2)将2.5g牛血清白蛋白在12.5mL悬浮液中(牛血清白蛋白与悬浮液的比例为1:5w/v)溶解分散均匀,加入18.75mL吸附剂分散液(牛血清白蛋白悬浮液与吸附剂分散液的比例为1:1.5v/v),在4℃搅拌30min后,在该温度10000rpm离心10min,收集上清;

  (3)在上清液中加入18.75mL吸附剂分散液,在4℃搅拌30min,在该温度10000rpm离心10min,收集上清液;再重复一次;

  (4)收集的上清用0.45μm膜过滤后,即得牛血清白蛋白纯化液,作为Heparin-Sepharose层析柱的上样样品;

  (5)用平衡液平衡Heparin-Sepharose层析柱5倍CV,流速为180ml/h,对上样样品进行纯化,收集穿透峰,上样完成后用平衡液洗脱至基线平稳;

  (6)采用分子截留量为10KD的超滤浓缩管2500rpm离心20min,对收集的穿透峰进行超滤浓缩,得到超滤牛血清白蛋白样品;

  (7)将超滤牛血清白蛋白样品采用分子截留量为14000Da的透析袋4℃条件下搅拌透析2h后,更换透析液透析过夜,超滤牛血清白蛋白样品与透析液的体积比为1:15;

  (8)透析后的样品测定蛋白浓度后,稀释至10mg/ml,分装成1mL/支,保存于-20℃。

  实施例4检测实施例1-3纯化的牛血清白蛋白去除核酸酶的效果

  检测实施例1-3中纯化的牛血清白蛋白去除核酸酶的效果,具体过程如下:

  (1)DNA体系中的模板、引物及探针

  DNA模板的制备:采用天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取试剂盒提取人血液中基因组DNA,用作反应模板,应用下述引物探针扩增β-激动蛋白(β-actin)基因,每个反应孔中DNA模板的量为0.05ng/T。

  正向引物:5’TTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG 3’

  反向引物:5’AAACTGGAACGGTGAAGGTGA 3’

  探针:5’-Cy5-CTTGCGCAGAAAACAAGATGAGATTGGC-BHQ3-3’

  (2)试剂

  10×PCR缓冲液包含100mM Tris-HCl、500mM KCl,pH为8.3。MgCl2、KCl购自广州化学试剂厂;三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自广州威佳生物科技有限公司;脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、脱氧尿嘧啶(dUTP)购自上海申能博彩生物科技有限公司;50X Superstart plus-UNG Robustart Taq(5U/μL)、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)(1U/μL),为珠海宝锐生物科技有限公司生产;引物及探针由上海生物工程(上海)股份有限公司合成。

  (3)体系配方表

  按照下表先将模板和未处理以及按照实施例1-3处理后的BSA(10mg/mL)进行混匀,25℃条件下放置1小时,让BSA样品和模板进行作用,反应结束后按照下表进行其他组分的添加,配置完成并混匀后立即上机,具体反应程序见以下反应条件。

  (4)反应条件

  荧光定量PCR仪:SLAN96P。

  50℃处理2min,95℃预变性5min;95℃变性10s、55℃退火40s,共50个循环。

  (5)实验结果

  反应结束后,将SLAN96P中Ct值导出,进行统计分析。

  表1 DNA检测不同BSA样品扩增的平均Ct值

  由图1以及表1可以看出,4种BSA样品添加反应体系在荧光值上基本一致。未处理的BSA、实施例1纯化的BSA和实施例2纯化的BSA样品在DNA检测中Ct值基本一致,没有显著差异;而本发明的方法纯化的BSA样品的反应体系Ct值为31.97,比其他BSA样品提前了1.6个Ct值。结果表明,未处理的BSA样品中有核酸酶,单独用硅藻土或Heparin-Sepharose层析柱纯化BSA样品均不能完全去除残留的核酸酶,而本发明硅藻土结合Heparin-Sepharos层析柱的纯化方法能够有效的去除BSA样品中残留的核酸酶,检测的灵敏度提高了2倍。

  实施例5检测实施例1-3纯化的牛血清白蛋白去除核酸酶的效果

  检测实施例1-3中纯化的牛血清白蛋白去除核酸酶的效果,具体过程如下:

  (1)RNA体系中模板、引物及探针

  RNA模板的制备:采用天根生化科技(北京)有限公司RNA提取试剂盒从人血液中提取总RNA,用作反应模板,应用下述引物探针扩增GAPDH基因,每个反应孔中RNA模板的量为5ng。

  正向引物:5’GTGAACCATGAGAAGTATGACAAC 3’

  反向引物:5’CATGAGTCCTTCCACGATACC 3’

  探针:5’-HEX-CCTCAAGATCATCAGCAATGCCTCCTG-BHQ1-3’

  (2)试剂

  氯化镁(MgCl2)、氯化钾(KCl)购自广州化学试剂厂;三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自广州威佳生物科技有限公司;脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、脱氧尿嘧啶(dUTP)购自上海申能博彩生物科技有限公司;5×反转录预混液(5×Neoscript RT Premix含反转录酶、热启动酶、dNTP、PCR buffer等)为珠海宝锐生物科技有限公司生产;引物及探针由上海生物工程(上海)股份有限公司合成。

  (3)体系配方组成

  按照下表先将RNA模板和4种不同方式处理的BSA样品进行混匀,25℃条件下放置1小时,让BSA样品和模板进行作用,反应结束后按照下表进行其余组分的添加,配置完成并混匀后立即上机,具体反应程序以下反应条件。

  (4)反应条件

  荧光定量PCR仪:SLAN96P。

  50℃逆转录15min,95℃预变性1min;95℃变性15s、56℃退火45s,共50个循环。

  (5)实验结果

  反应结束后,将SLAN96P中Ct值导出,进行统计分析。

  表2 RNA体系中不同BSA样品扩增的平均Ct值

  由图2以及表2可以看出,未处理的BSA样品的荧光值最低,而实施例1纯化的BSA、实施例2纯化的BSA以及实施例3纯化的BSA的荧光值基本一致,约为未处理的BSA样品的1.76倍。实施例1纯化的BSA样品比未处理的BSA样品提前7.18个Ct值;实施例1纯化的BSA样品和实施例2纯化的BSA样品的Ct基本相当,仅相差0.35;而本发明的方法纯化的BSA样品Ct值比未处理的BSA样品提前8.51个Ct值,比实施例1和实施例2纯化的BSA样品的Ct值提前约1。结果表明,在RNA体系检测中,未处理的BSA样品中存在大量残留的核酸酶,相对于本发明而言,25℃处理1小时后CT值推后了8.5个Ct值;实施例1和实施例2去除核酸酶的能力基本相当,而本发明的方法去除核酸酶的效果明显实施例1和实施例2的方法,Ct值提前了1,即相当于RNA检测中对RNA模板的检测灵敏度提高了一倍。

  牛血清白蛋白 篇2:

  牛血清白蛋白及其制备方法

  第一、技术领域

  本发明涉及牛血清白蛋白制备技术领域,具体而言,涉及一种牛血清白蛋白及其制备方法。

  第二、背景技术

  牛血清白蛋白是生命科学研究,免疫诊断检测常用的生化试剂,在科研和诊断产品开发上需求量很大。建立高纯度牛血清白蛋白的大规模生产方法是满足市场需求的根本途径。

  目前生产牛血清白蛋白的方法有利凡诺法、辛酸钠法、低温乙醇法和硫酸铵沉淀法。

  利凡诺法:利用利凡诺作为牛血清白蛋白保护剂,通过加热,使牛血清中的其他蛋白沉淀,采用离心或过滤的澄清技术,收获牛血清白蛋白。该方法主要的问题是产品纯度低,最高能达到90%纯度,并且利凡诺成本高,产生大量废弃物。

  辛酸钠法:以一定浓度辛酸钠作为牛血清白蛋白保护剂,在控制pH和温度的条件下,通过加热保温,使其他蛋白沉淀,获得牛血清白蛋白。该方法辛酸钠用量较小,不会产生大量废料,牛血清白蛋白纯度也比较高,能达到90%以上,但是不能达到95%以上高纯度,同时在提取过程中引入了高浓度的辛酸盐,增加了牛血清白蛋白中的脂肪酸含量,会对后期实验使用产生干扰,所以需要增加脂肪酸的去除工艺。

  低温乙醇法:以低温乙醇作为沉淀剂,对血浆蛋白选择性分批沉淀,最终获得牛血清白蛋白。该方法乙醇用量大,需要专门有机溶剂库房,需要大量耗能制备低温乙醇,同时白蛋白纯度只能达到80%以上,大量乙醇排放不能回收,造成严重环境污染。

  硫酸铵法:以一定浓度的硫酸铵作为沉淀剂,对绝大部分杂蛋白进行沉淀,再采用离心或者过滤等澄清手段,分离其他蛋白沉淀,获得纯度比较高的牛血清白蛋白。该方法生产的白蛋白纯度能达到90%以上,但是白蛋白收率偏低,只能达到1.2%左右的收率,并且最终产品的颜色偏红,冻干后产品复溶度差,溶液浑浊,不能满足高浓度白蛋白溶液的实际应用,生产过程中产生了大量的硫酸铵废弃物,造成环境污染。

  牛血清白蛋白是在生命科学和诊断检测中最常用的一种生化试剂,近年来生命科学和免疫诊断在快速发展,牛血清白蛋白的需求量迅速增加,需要吨级的供应量才能满足整个行业的需求。国内的血清白蛋白生产企业大都采用以上的方法进行生产,最终产品的外观和理化性质均不能达到精准实验的要求。以至于很多企业完全依靠大量进口牛血清白蛋白才能做出稳定的诊断试剂产品。因此,开发规模化制备高品质牛血清白蛋白的方法是支持科研满足诊断需求的关键因素。

  从牛血浆中提取牛血清白蛋白经历了很长的时间和很多的技术改进。目前,能够达到科研和检测应用标准的牛血清白蛋白,必须是纯度高(98%以上)、残留杂质对实验干扰小(低内毒素、低蛋白酶、低脂肪酸),蛋白稳定性好。血浆复杂的组分对牛血清白蛋白的分离造成了很大的障碍。以往采用的方法为了追求高纯度,难免会通过烈性条件影响白蛋白本身的品质,或者是引入其他杂质。

  鉴于此,特提出本发明。

  第三、发明内容

  本发明的目的在于提供一种牛血清白蛋白及其制备方法,本发明提供的牛血清白蛋白的制备方法能够提高牛血清白蛋白的纯度和收率,减少杂质,有效提高白蛋白的品质。

  本发明是这样实现的:

  第一方面,本发明提供一种牛血清白蛋白的制备方法,其包括:往牛血浆稀释液中加入硫酸铵以使得到的混合溶液的电导率为500mS/cm-600mS/cm。

  本发明提供的制备方法,以硫酸铵盐析沉淀蛋白为技术基础,对其进行改进,该方法以混合溶液的电导率作为控制蛋白沉淀的技术参数进行精准的盐浓度控制,在常温下可以使绝大部分的杂蛋白都被沉淀,大大地提高了终产品牛血清白蛋白的纯度,高达98%以上,并有效减少了杂质,提高了牛血清白蛋白的品质。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述电导率为520mS/cm-580mS/cm。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述电导率为530mS/cm-560mS/cm。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述电导率为530mS/cm、550mS/cm或560mS/cm。进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述牛血浆稀释液为牛血浆与水混合得到。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述牛血浆与水的体积比为1:1-2。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述制备方法还包括:在加入硫酸铵之后,对所述混合溶液进行搅拌。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,搅拌的时间为1-2小时。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述制备方法还包括:在搅拌结束后,将所述混合溶液静置。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,静置的时间为2-4小时。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述制备方法还包括:在静置结束后,对所述混合溶液进行提纯,得到提纯液。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述提纯的方法包括:将所述混合溶液进行固液分离,去除沉淀,取过滤液进行超滤脱盐,然后进行缓冲液置换。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,固液分离的方式为过滤或板框压滤。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,采用分子截留量为8-12kD的中空纤维柱进行超滤。超滤可以对提纯液进行脱盐,以便于下一步得工艺实施。提纯液里的蛋白是大分子物质,可被截留,而无机盐是小分子,利用超滤设备可以把无机盐从蛋白液中分离出来。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,采用分子截留量为10kD的中空纤维柱进行超滤。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,进行缓冲液置换所用的缓冲液为磷酸盐缓冲液。

  在其他的实施例中,也可以使用纯净水进行置换。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,磷酸盐缓冲液的pH为7.4。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述制备方法还包括:去除所述提纯液中的色素。

  将提纯液中的色素去除,减少杂质,并且可以保证产品的外观洁白干净。而现有的制备方法通常没有此步骤。

  进一步地,在本发明的一些实施方案中,采用大孔吸附树脂柱对所述提纯液进行层析去除色素。

  采用大孔吸附树脂柱层析,可以有效地去除提纯液中的色素,减少杂质,提高产品的澄清度。

  第二方面,本发明提供一种牛血清白蛋白制品,其由如上任一项所述的制备方法制得。

  第四、附图说明

  为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

  图1为实施例1-3提供的牛血清白蛋白冻干粉的SDS-PAGE电泳结果,图中:泳道1-4为进口四个牛血清白蛋白样品,泳道5-6为国产两个牛血清白蛋白样品,泳道7-9分别是本发明实施例1-3的牛血清白蛋白。

  第五、具体实施方式

  为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。

  以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

  实施例1

  本实施例提供的制备牛血清白蛋白的方法如下:

  准确量取100L纯净水与70L牛血浆混合,充分搅拌稀释;往牛血浆稀释液中加入75kg硫酸铵以使混合溶液(即牛血浆稀释液与硫酸铵的混合)的电导率为560mS/cm;搅拌1小时,静置3小时,然后过滤或者板框压滤澄清,除去沉淀,过滤液采用10kD中空纤维柱超滤脱盐,然后进行缓冲液(磷酸盐缓冲液,pH7.4)置换,上大孔吸附树脂柱,吸附色素后再超滤浓缩至20%浓度,冷冻干燥。得冻干粉1800g,回收率2.57%,冻干粉电泳检测,SDS-PAGE电泳结果见图1,纯度在99%以上,复溶液清亮透明,色泽为淡黄色,属高纯度白蛋白溶解特征。

  实施例2

  本实施例提供的制备牛血清白蛋白的方法如下:

  准确量取400L纯净水与280L牛血浆混合,充分搅拌稀释;往血浆稀释液中加入300kg硫酸铵以使混合溶液的电导率为550mS/cm;搅拌1小时,静置3小时,然后过滤或者板框压滤澄清,除去沉淀,过滤液采用10kD中空纤维柱超滤脱盐,然后进行缓冲液(磷酸盐缓冲液,pH7.4)置换,上大孔吸附树脂柱,吸附色素后再超滤浓缩至20%浓度,冷冻干燥。得冻干粉7460g,回收率2.66%。冻干粉电泳检测,SDS-PAGE电泳结果见图1,纯度在99%以上,复溶液清亮透明,色泽为淡黄色,属高纯度白蛋白溶解特征。

  实施例3

  准确量取1500L纯净水与1000L牛血浆混合,充分搅拌稀释;往血浆稀释液中加入1080kg硫酸铵以使混合溶液的电导率为530mS/cm;搅拌1小时,静置3小时,然后过滤或者板框压滤澄清,除去沉淀,过滤液采用10kD中空纤维柱超滤脱盐,然后进行缓冲液(磷酸盐缓冲液,pH7.4)置换,上大孔吸附树脂柱,吸附色素后再超滤浓缩至20%浓度,冷冻干燥。得冻干粉27000g,回收率2.7%。冻干粉电泳检测,SDS-PAGE电泳结果见图1,纯度在99%以上,复溶液清亮透明,色泽为淡黄色,属高纯度白蛋白溶解特征。

  对比例1

  本对比例与实施例1的方法基本相同,不同的是,加入硫酸铵以使混合溶液的电导率低于500mS/cm,具体为480mS/cm。得到的冻干粉纯度为75%。

  对比例2

  本对比例与实施例1的方法基本相同,不同的是,加入硫酸铵以使混合溶液的电导率高于600mS/cm具体为610mS/cm。得到的冻干粉纯度与实施例1基本保持一致,但是产率大幅度下降,产量只有实施例1的50%左右,回收率约为1.2%。

  综上可以看出,经过连续生产三批(实施例1-3)以上,样品经检测批间差细微,说明该本发明提供的制备方法可以稳定制备牛血清白蛋白。经过十几倍放大后,产品依然保持稳定的检测参数标准,证明该方法的规模化生产可行性。此外,本发明的实施例的终产品经多家诊断试剂厂试用后,其效果完全和进口试剂(罗氏等品牌)性能效果相当。

  本发明提供的制备方法具有周期短(提取分离仅两天),不耗能(室温反应),无污染物引入(硫酸铵本身是化肥,并且被回收循环使用),无废渣产生(其他蛋白没有变性,还可再深加工),纯度高,该方法最大限度地利用了血浆组分的潜在价值,在所有白蛋白生产方法中,成本最低,最环保。

  以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

  牛血清白蛋白 篇3:

  牛血清白蛋白传感器检测、吸附水中重金属离子的方法

  第一、技术领域

  本发明属于生物-无机杂化技术领域,特别是涉及一种牛血清白蛋白传感器检测、吸附水中重金属离子的方法。

  第二、背景技术

  基于活性生物分子与无机纳米材料组装得到的生物-无机纳米杂化材料同时具有二者的独特性质,已成为生命科学、材料科学及纳米科学等领域的研究热点。以无机材料为出发点,无机—生物杂化材料主要体现在以下三个方面:(1)基于零维的纳米粒子形成的无机—生物杂化材料。半导体纳米粒子如(CdS,CdSe,ZnS,TiO2等)或金属纳米粒子(如Au)可与酶、抗原、抗体或核酸如DNA等蛋白质偶联实现功能化,也可在生物活性分子诱导下组装成某种排列结构,功能化的纳米粒子可控制生物分子的活性、反应性或识别能力,无机纳米颗粒与生物分子在溶液或基质表面形成的二维或三维组装体可望作为生物传感器、生物电子器件等得到应用;(2)基于一维的碳纳米管和三维的介孔材料形成的无机—生物杂化材料。单壁碳纳米管(SWNT)作为纳米材料的重要单元在电子、光学、热量传输和生物传感等领域具有广阔的应用前景;(3)基于纳米颗粒和—维的碳纳米管以及三维的介孔材料组装得到的杂化材料具有一定的局限性,尤其是活性生物分子为酶分子时,酶分子不能充分地与反应物分子接触,导致活性和利用率下降。针对上述局限性,近年来二维纳米材料即层状材料(如d-磷酸锆、层状钛酸盐、水滑石)与生物分子的组装受到越来越多的关注。与上述提到的半导体或金属纳米颗粒不同,层状材料与生物分子的组装可通过主客体之间的离子键、氢键、憎水作用等形式实现,因而避免了共价作用形式所需要的苛刻反应条件,更有利于保持生物分子特有的结构和生物活性。

  蛋白质是由20多种氨基酸共价连接而成、具有特定三维结构、高分子量的多肽。所以把多肽作为认识蛋白质的起点是合适的。一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键,所形成的化合物称为肽(peptide)。组成肽链的氨基酸单元称为氨基酸残基。蛋白质分子中氨基酸残基的排列方式和连接顺序就是蛋白质的化学结构(一级结构)。肽分子中含有两个氨基酸残基时称为二肽,肽分子中含有多个氨基酸残基时则称为多肽。肽键中的C-N键具有部分双键性质,不能自由旋转。蛋白质有一个引人注目的特征,就是它们都具有确定的三维结构。虽然蛋白质分子是由氨基酸首尾相连的多肽链组成,但一个伸展开来或随机排布的多肽链并无生物活性。蛋白质的功能来自其特定的构象,即原子在一个结构中的三维排列方式。蛋白质由氨基酸结合而成,结合方式是通过肽键结合而成肽链,再由一个或多个肽链按各自特殊的方式结合成为蛋白质分子。

  牛血清白蛋白是血液的主要成分(38g/100ml),由于具有纯度高,价格便宜,商业易得等特点,常常作为标准蛋白质研究。牛血清白蛋白由三个氨基酸区域组成,每个氨基酸区域包含两个亚域,一个BSA分子由583个氨基酸组成,其中35个半胱氨酸组成17个二硫键,在肽链的第34位有一自由巯基,分子量68kD,等电点4.8,含氮量16%,含糖量0.08%,仅含已糖和已糖胺,含脂量只有0.2%。游离的BSA分子结构以a-helix为主,三维尺寸为4*4*14nm,分子量为66KD,等电点是4.9,是一种酸性蛋白质。与所有蛋白质一样,牛血清白蛋白分子的大小以及表面的电荷分布随蛋白质溶液pH值的变化而变化,因此可以调节缓冲溶液的pH值,将牛血清白蛋白阴离子化或者是阳离子化。在中性(pH=7.4)蛋白质溶液中,牛血清白蛋白呈扁形椭圆体,表面电荷以负电荷为主,主要分布在氨基一区和氨基二区。牛血清白蛋白的单肽链中的134和213位色氨酸残基(w);30,84,137,139,147,149,155,156,160,262,318,331,333,340,352,369,400,410,451,496位的20个酪氨酸残基(Y);11,19,27,36,49,70,102,126,133,148,164,205,222,227,308,325,329,373,394,487,501,506,508,550,553,56726个苯丙氨酸残基。

  无机—生物杂化材料很好的结合了无机纳米材料和活性生物分子两者的特性和优点,要想充分发挥活性生物分子的生物活性,选择合适的无机主体成为了制备性能优异无机—生物杂化材料的关键问题。水滑石(LDH)是一种阴离子粘土,其基本构造单元是八而体,八面体中心是金属离子,六个顶角是氢氧根离子,相邻八面体之间靠共用边相互联结成二维延续的配位八面体结构层,单元层以面一面堆叠形成晶体颗粒构成层状结构,决定了它多以片状形态存在。水滑石结构中类水滑石层板由共边的M(OH)6八面体构成,部分二价金属离子被三价金属离子取代产生多余的正电荷,使得LDH带正电荷,晶体结构中多余的正电荷由层间阴离子平衡以维持整个分子的电中性,层间通道中的阴离子是可交换的水滑石由于主体层板的化学组成、电荷密度、晶粒形态和尺寸均可以在一定范围内调控等特性恰好可以解决上述存在的问题,为LDHs-生物杂化材料的设计提供了较大的设计空间。另外,水滑石作为一类阴离子型层状材料,可以在水中剥离从而得到单层层板,这样分子尺寸较大的生物活性分子就能够与LDHs组装得到LDHs-生物杂化材料,实现生物分子的应用。

  重金属指比重大于4或5的金属,约有45种,如铜、铅、锌、铁、钴、镍、钒、铌、钽、钛、锰、镉、汞、钨、钼、金、银等。尽管锰、铜、锌等重金属是生命活动所需要的微量元素,但是大部分重金属如汞、铅、镉等并非生命活动所必须,而且所有重金属超过一定浓度都对人体有毒。从环境污染方面,重金属是指汞、镉、铅、铬及“类金属”-----砷等生物毒性显著的重金属。对人体毒害最大的有5种:铅、汞、铬、砷、镉。这些重金属在水中不能被分解,人饮用后毒性放大,与水中的其他毒素结合生成毒性更大的有机物。重金属一般以天然浓度广泛存在于自然界中,但由于人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多,造成不少重金属如铅、汞、镉、钴等进入大气、水、土壤中,引起严重的环境污染。以各种化学状态或化学形态存在的重金属,在进入环境或生态系统后就会存留、积累和迁移,造成危害。如随废水排出的重金属,即使浓度小,也可在藻类和底泥中积累,被鱼和贝类的体表吸附,产生食物链浓缩,从而造成公害。如日本的水俣病,就是因为烧碱制造工业排放的废水中含有汞,在经生物作用变成有机汞后造成的;又如痛病,是由炼锌工业和镉电镀工业所排放的镉所致。汽车尾气排放的铅经大气扩散等过程进入环境中,造成目前地表铅的浓度已有显著提高,致使近代人体内铅的吸收量比原始人增加了约100倍,损害了人体健康。重金属污染的特点表现在以下几方面:

  (1)水体中的某些重金属可在微生物作用下转化为毒性更强的金属化合物,如汞的甲基化作用就是其中典型例子;

  (2)生物从环境中摄取重金属可以经过食物链的生物放大作用,在较高级生物体内成千万倍地富集起来,然后通过食物进入人体,在人体的某些器官中积蓄起来造成慢性中毒,危害人体健康;

  (3)在天然水体中只要有微量重金属即可产生毒性效应,一般重金属产生毒性的范围大约在1—l0mg/L之间,毒性较强的金属如汞、镉等产生毒性的质量浓度范围在0.01—0.001mg/L之间。

  第三、发明内容

  本发明的目的在于提供一种牛血清白蛋白传感器检测、吸附水中重金属离子的方法。用牛血清白蛋白传感器能对水体中的重金属离子实现实时检测及吸附,解决了重金属污染一直是困扰人类的一个难题;因为重金属可以通过呼吸、食物链、皮肤接触等方式进入人体,由于重金属不能生物降解,人体中的重金属不断富集,对人体的健康乃至生命安全构成严重威胁。

  牛血清白蛋白分子含有丰富的荧光发射基团如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸,重金属离子导致牛血清白蛋白的荧光发生猝灭,牛血清白蛋白的荧光强度变化与固定的重金属离子的量成线性关系;随着水体中重金属离子浓度的增加,牛血清白蛋白分子的荧光发生有规律的猝灭,牛血清白蛋白荧光强度的变化与水体中重金属离子的初始浓度呈现良好的线性关系。依据上述线性关系实现对水体中重金属离子的检测与吸附。所述水滑石为乳酸根插层镁铝水滑石,蛋白质为牛血清白蛋白(第五组分)。

  本发明是将牛血清白蛋白与水滑石纳米片自组装制备牛血清白蛋白传感器,用牛血清白蛋白传感器检测、吸附水中的重金属离子。工艺步骤为:

  (1)水滑石纳米片的制备:将3.7513g的Al(NO3)3·9H2O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)溶于60mL去离子水中,配制成Mg/Al为2/1的盐溶液。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中,调节体系的pH值6-11;加入Mg/Al混合盐溶液,继续滴加NaOH溶液至pH值6-11,加热至回流并晶化7-12小时,得到白色浆液,离心分离,洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石白色浆液洗涤至中性后,在一定体积水中分散,加热回流至剥离。所制备的乳酸根插层镁铝水滑石具有高度结晶的晶体结构,在水中分散剥离得到水滑石纳米片。

  (2)牛血清白蛋白传感器的制备

  a、缓冲溶液的配制:配制0.2mol/L的磷酸氢二钠和0.3mol/L的磷酸二氢钠溶液,以此配制pH5.0-9.0的缓冲溶液,用于溶解牛血清白蛋白;

  b、调节牛血清白蛋白溶液的pH5.0-9.0,配制浓度为0.5-3mg/ml的蛋白质溶液,组装前牛血清白蛋白溶解30-120分钟;

  c、将牛血清白蛋白溶液与水滑石纳米片混合,15-40℃的条件下自组装30-120分钟后,将处理过的基底浸渍在组装体系中15-40分钟,清洗干燥;在低至40ppb的浓度范围内,牛血清白蛋白传感器能对重金属离子实现定性检测,在1-100ppm以上的浓度范围内,牛血清白蛋白传感器能对水体中的重金属离子实现实时检测及吸附;

  d、将处理过的基底交替浸渍到水滑石纳米片和牛血清白蛋白溶液中各15-30分钟,中间取出水洗并干燥,制得的牛血清白蛋白传感器在水体中稳定。

  (3)牛血清白蛋白传感器与重金属离子反应

  a、配制浓度为0.01-100ppm的重金属离子溶液,将牛血清白蛋白传感器与重金属离子溶液反应30-120分钟;

  b、计算牛血清白蛋白传感器对重金属离子的吸附量,关联荧光强度变化与重金属离子的量;

  c、表征反应后的牛血清白蛋白的荧光光谱强度,关联荧光强度变化与重金属离子的初始浓度;所制备的牛血清白蛋白传感器能对水体中痕量的重金属离子实现在线检测及吸附。

  本发明的牛血清白蛋白传感器对水体中40ppb的重金属离子能够实现定性检测,在1-100ppm重金属离子浓度范围内,牛血清白蛋白传感器对水体中的重金属离子能够实现在线实时检测及吸附,具有潜在的应用价值。

  本发明的优点在于,用的牛血清白蛋白传感器能够对水体中的重金属离子实现实时检测及吸附,同时制备工艺简单,不需要复杂的设备,成本低廉,具有实际应用的价值。

  第四、附图说明

  图1为牛血清白蛋白的荧光光谱强度随水体中重金属离子浓度的增加有规律的猝灭。

  第五、具体实施方式

  实施例1

  a、将3.7513g的Al(NO3)3·9H2O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)溶于60mL去离子水中。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中,调节体系的pH值6-11;加入Mg/Al混合盐溶液,继续滴加NaOH溶液至pH值6-11,加热至回流并晶化7-12小时,得到白色浆液,离心分离,洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石洗涤至中性后,在一定体积水中分散,加热回流至剥离;

  b、在pH6.0的条件下,配制浓度为2mg/ml牛血清白蛋白溶液30ml,加入10ml水滑石纳米片,组装1h;

  c、将处理过的基底浸渍到上述反应体系中30分钟,取出水洗并干燥,得到牛血清白蛋白传感器;

  d、将牛血清白蛋白传感器与系列浓度的重金属溶液反应,表征反应前后杂化膜的光谱特征及对重金属离子的吸附能力。

  实施例2

  a、将3.7513g的Al(NO3)3·9H2O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)溶于60mL去离子水中。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中,调节体系的pH值6-11;加入Mg/Al混合盐溶液,继续滴加NaOH溶液至pH值6-11,加热至回流并晶化7-12小时,得到白色浆液,离心分离,洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石洗涤至中性后,在一定体积水中分散,加热回流至剥离;

  b、在pH7.0的条件下,配制浓度为1.5mg/ml牛血清白蛋白溶液30ml,加入10ml水滑石纳米片,组装1h;

  c、将处理过的基底浸渍到上述反应体系中30分钟,取出水洗并干燥,得到牛血清白蛋白传感器;

  d、将牛血清白蛋白传感器与系列浓度的重金属溶液反应,表征反应前后杂化膜的光谱特征及对重金属离子的吸附能力。

  实施例3

  a、将3.7513g的Al(NO3)3·9H2O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)溶于60mL去离子水中。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中,调节体系的pH值6-11;加入Mg/Al混合盐溶液,继续滴加NaOH溶液至pH值6-11,加热至回流并晶化7-12小时,得到白色浆液,离心分离,洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石洗涤至中性后,在一定体积水中分散,加热回流至剥离;

  b、在pH5.0的条件下,配制浓度为3mg/ml的牛血清白蛋白溶液;

  c、将处理过的基底浸渍到50ml水滑石纳米片中30分钟,取出水洗并干燥;

  d、将上述预铺了一层水滑石薄膜的基片浸渍到2mg/ml的牛血清白蛋白溶液中30分钟,取出水洗并干燥;

  e、重复c和d步骤,制备牛血清白蛋白传感器

  f、将牛血清白蛋白传感器与系列浓度的重金属溶液反应,表征反应前后杂化膜的光谱特征及对重金属离子的吸附能力。

  实施例4

  a、将3.7513g的Al(NO3)3·9H2O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)溶于60mL去离子水中。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中,调节体系的pH值6-11;加入Mg/Al混合盐溶液,继续滴加NaOH溶液至pH值6-11,加热至回流并晶化7-12小时,得到白色浆液,离心分离,洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石洗涤至中性后,在一定体积水中分散,加热回流至剥离;

  b、在pH7.0的条件下,配制浓度为1.5mg/ml的牛血清白蛋白溶液;

  c、将处理过的基底浸渍到50ml水滑石纳米片中30分钟,取出水洗并干燥;

  d、将上述预铺了一层水滑石薄膜的基片浸渍到3mg/ml的牛血清白蛋白溶液中30分钟,取出水洗并干燥;

  e、重复c和d步骤,制备牛血清白蛋白传感器;

  f、将牛血清白蛋白传感器与系列浓度的重金属溶液反应,表征反应前后杂化膜的光谱特征及对重金属离子的吸附能力。

  实施例5

  a、将3.7513g的Al(NO3)3·9H2O和5.1280g的硝酸镁(Mg(NO3)2·6H2O)溶于60mL去离子水中。将一定浓度的NaOH溶液缓慢滴加到过量乳酸中,调节体系的pH值6-11;加入Mg/Al混合盐溶液,继续滴加NaOH溶液至pH值6-11,加热至回流并晶化7-12小时,得到白色浆液,离心分离,洗涤烘干。取上述乳酸插层水滑石洗涤至中性后,在一定体积水中分散,加热回流至剥离;

  b、在pH8.0的条件下,配制浓度为3mg/ml的牛血清白蛋白溶液;

  c、将处理过的基底浸渍到50ml水滑石纳米片中20分钟,取出水洗并干燥;

  d、将上述预铺了一层水滑石薄膜的基片浸渍到3mg/ml的牛血清白蛋白溶液中30分钟,取出水洗并干燥;

  e、重复c和d步骤,制备牛血清白蛋白传感器;

  f、将牛血清白蛋白传感器与系列浓度的重金属溶液反应,表征反应前后杂化膜的光谱特征及对重金属离子的吸附能力。

  牛血清白蛋白 篇4:

  叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料

  第一、技术领域

  本发明涉及叶酸-牛血清白蛋白-纳米铂铋纳米复合材料及其制备方法,并提供一 种基于叶酸-牛血清白蛋白-纳米铂铋纳米复合材料快速灵敏地检测叶酸受体高表达的肿 瘤细胞的方法和检测试剂盒。属于纳米技术和生命分析技术领域。

  第二、背景技术

  叶酸是一种小分子维生素,广泛分布在人体中,起重要的生理作用。自1986年科学 家发现叶酸是由受体介导的内吞途径进入细胞以来,人们开始对叶酸作为靶向载体进行深 入研究。专家已经证实在卵巢癌、肾癌、头颈部肿瘤、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等恶性上皮组 织来源肿瘤、关节炎部位有过表达的叶酸受体。因此,叶酸作为其靶向标记物,能够和叶酸 受体进行特异性结合就能与叶酸受体特异性结合并选择性浓集于叶酸受体表达丰富的组 织(肿瘤)中,如果对结合的叶酸做颜色等标记,我们便可以从各种医学显影手段上定位观 察出病灶浓集的区域,并针对该区域进行治疗,其集中性、准确性对于癌症治疗的疗效提供 了巨大的帮助。与其他靶向分子如单克隆抗体相比,叶酸相对分子质量小、无免疫原性、价 廉易得、稳定性好、与药物或载体之间的化学键合简单易行。

  生物分子复合纳米材料是在对生物矿化分子进行充分研究的基础上,利用矿化分 子中的小肽和蛋白质设计和制备的无机纳米材料。利用蛋白质为模板制备的复合纳米材料 在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围或者由该尺度范围的物质为基本结构单元所 构成,其尺度已经接近光的波长并且具有大表面的特殊效应,因此该类材料是一种典型的 介观系统,具有表面效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应和量子限域效应。

  本发明以牛血清白蛋白为模板,制备一种牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料,通过 蛋白质羧基和叶酸分子的氨基进行交联反应,合成叶酸-牛血清白蛋白-纳米铂铋纳米复合 材料。该纳米复合材料具有模拟过氧化物酶活性并能与叶酸受体特异性结合,可用于快速 灵敏地检测叶酸受体高表达的肿瘤细胞检测。

  第三、发明内容

  本发明的目的是以牛血清白蛋白为模板,制备一种牛血清白蛋白-铂铋纳米复合 材料,以及通过蛋白质羧基和叶酸分子的氨基进行交联反应,提供一种合成叶酸-牛血清白 蛋白-纳米铂铋纳米复合材料的方法。该纳米复合材料具有模拟过氧化物酶活性并能与叶 酸受体特异性结合,可用于快速灵敏地检测叶酸受体高表达的肿瘤细胞检测。

  为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:

  本发明所述的一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料,其特征是由以下方法制备 而成的:在叶酸水溶液中,加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺,反应后,加入牛 血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液,反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管,6000 r/min离心超滤,并水洗3次,得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液,将叶酸- 牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合 材料粉末;所述叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料具有模拟过氧化物酶活性,能催化 过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色,并能识别细胞膜表面叶酸受体。

  所述的一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料,其特征是在2.79mL浓度为 100mmol/L,pH=5的磷酸盐缓冲液中依次加入1mL浓度为2mol/L的过氧化氢、0.2mL浓 度为16mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐、10μL浓度为4.76mg/mL的叶酸-牛血 清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液,37℃温浴10分钟,溶液由无色变为蓝色,在652nm 处有吸收峰。

  所述的一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料,其特征是能与人乳腺癌细胞 MCF-7细胞膜上高表达的叶酸受体特异性识别并结合,而不与低表达叶酸受体的正常细胞 人脐带静脉融合细胞EAhy926结合,通过催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸 盐生成蓝色产物,该蓝色产物在652nm处有最大吸收峰。

  本发明所述的一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的制备方法,其特征是 在叶酸水溶液中,加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺,反应后,加入牛血清白蛋 白-铂铋纳米复合材料水溶液,反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管,6000r/min离心 超滤,并水洗3次,得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液,将叶酸-牛血清白蛋 白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料粉末。

  所述的一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料制备方法,其特征是在1mL浓 度为6.8mmol/L的叶酸水溶液中,加入1mL浓度为40mmol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙 基)-碳化二亚胺,反应15min后,加入5mL浓度为4.76mg/mL的牛血清白蛋白-铂铋纳米复 合材料水溶液,室温磁力搅拌反应2小时,反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管,6000 r/min离心超滤,并水洗3次,得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液,将叶酸- 牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合 材料粉末。

  本发明所述的一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料制备方法,其特征是所 使用的牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料由以下方法制备的:在5mL浓度为50mg/mL的牛 血清白蛋白水溶液中加入5mL浓度为16mmol/L氯铂酸溶液和0.5mL浓度为1.5mol/L氢 氧化钠溶液,混匀后水浴80℃反应2h,反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管,6000 r/min离心超滤,并水洗3次,得到牛血清白蛋白-纳米铂水溶液,将牛血清白蛋白-纳米铂水 溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-纳米铂粉末;在0.6mL浓度为23.8mg/mL的牛血清白蛋 白-铂水溶液中加入0.6mL浓度为0.5mmol/L的硝酸铋溶液和1.8mL浓度为10mmol/L, pH=7的磷酸盐缓冲液,混匀后水浴80℃反应2.5h,反应后溶液装入截止分子量为3k的超 滤管,6000r/min离心超滤,并水洗3次,得到牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的水溶液, 将牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材 料粉末。

  本发明所述的一种基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的肿瘤细胞检测 试剂盒,其特征是试剂盒中有叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料溶液、3,3’,5,5’-四 甲基联苯胺盐酸盐溶液、过氧化氢溶液和硫酸溶液,所述叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复 合材料溶液作为a液,3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液作为b液,过氧化氢溶液作为c 液,硫酸溶液作为终止液。

  所述a液中含有浓度为0.238mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的 RPMI-1640培养液;b液中含有浓度为16mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐水溶 液;c液中含有用浓度为100mmol/L,pH=5的磷酸缓冲液配制的浓度为1.05mol/L的过氧 化氢溶液;终止液中含有浓度为0.5mol/L的硫酸溶液。

  本发明所述的一种基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的肿瘤细胞检测 试剂盒,其特征是能用于测定叶酸受体高表达的MCF-7细胞,能区别肿瘤细胞和正常细胞。

  本发明所述的基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的肿瘤细胞检测试剂 盒的测定方法,包括如下步骤:在96孔板中每实验孔分别加入200μLMCF-7细胞悬液,培养 液为含6wt%胎牛血清的RPMI-1640,培养箱中37℃,体积分数5%二氧化碳条件下培养24小时 待完全贴壁,移除培养液,每实验孔分别加入200μL的a液,培养箱中37℃,体积分数5%二氧 化碳条件下孵育1.5小时,移除培养液,用浓度为10mmol/L,pH=7.4的磷酸缓冲液轻轻吹 打冲洗3次,每孔依次加入10μL的b液,190μL的c液,充分振荡混匀后,37℃反应15分钟,加 入50μL的终止液,用酶标仪测定450nm处的吸光度。

  本发明采用的具体技术方案为:

  (一)牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的制备:在5mL浓度为50mg/mL的牛血清白蛋 白水溶液中加入5mL浓度为16mmol/L氯铂酸溶液和0.5mL浓度为1.5mol/L氢氧化钠溶 液,混匀后水浴80℃反应2h,反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管,6000r/min离心 超滤,并水洗3次,得到牛血清白蛋白-纳米铂水溶液,将牛血清白蛋白-纳米铂水溶液冷冻 干燥得到牛血清白蛋白-纳米铂粉末。在0.6mL浓度为23.8mg/mL的牛血清白蛋白-纳米铂 水溶液中加入0.6mL浓度为0.5mmol/L的硝酸铋溶液和1.8mL浓度为10mmol/L,pH=7的 磷酸盐缓冲液,混匀后水浴80℃反应2.5h,反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管, 6000r/min离心超滤,并水洗3次,得到牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的水溶液。将牛血 清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料粉末。 制备过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡,并用双蒸水彻底清洗,晾干。

  (二)叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的制备:在1mL浓度为6.8mmol/L的 叶酸水溶液中,加入1mL浓度为40mmol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺, 反应15min后加入5mL方案(一)所制备的浓度为4.76mg/mL的牛血清白蛋白-铂铋纳米 复合材料水溶液,室温磁力搅拌反应2小时。反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管, 6000r/min离心超滤,并水洗3次,得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液,将 叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳 米复合材料粉末。以上过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡,并用双蒸水彻底清洗, 晾干。

  (三)叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料模拟过氧化物酶活性:在2.79mL浓 度为100mmol/L,pH=5的磷酸盐缓冲液中依次加入1mL浓度为2mol/L的过氧化氢,0.2mL 浓度为16mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐,10μL浓度为4.76mg/mL的叶酸-牛 血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液,37℃温浴10分钟,测定652nm处的吸光度。

  (四)基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料比色法检测叶酸受体高表达的 肿瘤细胞:细胞膜表面高表达叶酸受体的肿瘤细胞人乳腺癌细胞MCF-7为实验组;细胞膜表 面低表达叶酸受体的正常细胞人脐带静脉融合细胞EAhy926为阴性对照组。待细胞在96孔 板内完全贴壁后,每孔各加47.6μg叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料与细胞孵育1.5 小时。每个反应孔用磷酸盐缓冲液轻轻吹打冲洗3次,去除未结合的叶酸-牛血清白蛋白-铂 铋纳米复合材料。每孔依次加入磷酸盐缓冲液,过氧化氢和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸 盐,充分振荡混匀后,室温下反应15分钟,加入0.5mol/L浓硫酸终止反应。用酶标仪测定 每个反应孔在450nm处的吸光度,根据颜色变化或吸光度对细胞进行检测。

  本发明的另一个目的在于提供一种基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料 模拟过氧化物酶活性的叶酸受体高表达肿瘤细胞检测试剂盒。试剂盒中包括提供叶酸-牛 血清白蛋白-铂铋纳米复合材料溶液(a液),3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液(b液),过 氧化氢溶液(c液),硫酸溶液(终止液)。

  为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:

  (五)叶酸受体高表达肿瘤细胞检测试剂盒:a液包括含有浓度为0.238mg/mL的叶酸- 牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的RPMI-1640培养液;b液包括浓度为16mmol/L的3,3’, 5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐水溶液;c液包括用浓度为100mmol/L,pH=5的磷酸缓冲液配制 的浓度为1.05mol/L的过氧化氢溶液;终止液包括浓度为0.5mol/L的硫酸溶液。

  (六)叶酸受体高表达肿瘤细胞检测方法:培养液为含6%胎牛血清的RPMI-1640, 培养环境为恒温37℃的5%二氧化碳培养箱。将细胞加入至96孔板中,培养箱中培养24小时 待完全贴壁。每孔加入200μL技术方案(五)的a液,培养箱中孵育1.5小时。用浓度为10 mmol/L,pH=7.4的磷酸盐缓冲液轻轻吹打冲洗3次,每孔依次加入10μL技术方案(五)的b 液和190μl技术方案(五)的c液,充分振荡混匀后,37℃下反应15分钟,加入50μL终止液终 止反应,用酶标仪测定每个反应孔在450nm处的吸光度。

  本发明的优点:

  (1)本发明的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料制备方法简单易行。

  (2)本发明的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料具有良好的过氧化物酶活 性。

  (3)本发明的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料能特异性结合叶酸受体,经 过显色反应,目视观察和吸光度测定均可以检测出叶酸受体高表达肿瘤细胞。

  (4)本发明提供的叶酸受体高表达肿瘤细胞检测试剂盒,具有操作简便、稳定性 好、灵敏度高、特异性强等优点,易于推广使用。

  第四、附图说明

  图1为叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四 甲基联苯胺盐酸盐显色体系的紫外吸收光谱图。

  图2为叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料用于细胞检测的吸光度对比图。(a) 空白对照组;(b)叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料无细胞对照组;(c)牛血清白蛋白- 铂铋纳米复合材料人乳腺癌细胞MCF-7组;(d)叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人乳 腺癌细胞MCF-7组;(e)叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人乳腺癌细胞MCF-7叶酸封 闭组;(f)叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人脐带静脉融合细胞EAhy926组。

  图3为MCF-7细胞测定显色体系吸光度与细胞数关系图。

  第五、具体实施方式

  实例1:

  在5mL浓度为50mg/mL的牛血清白蛋白水溶液中加入5mL浓度为16mmol/L氯铂酸溶 液和0.5mL浓度为1.5mol/L氢氧化钠溶液,混匀后水浴80℃反应2h,反应后溶液装入截 止分子量为3k的超滤管,6000r/min离心超滤,并水洗3次,得到牛血清白蛋白-纳米铂水溶 液,将牛血清白蛋白-纳米铂水溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-纳米铂粉末。在0.6mL浓 度为23.8mg/mL的牛血清白蛋白-铂水溶液中加入0.6mL浓度为0.5mmol/L的硝酸铋溶液 和1.8mL浓度为10mmol/L,pH=7的磷酸盐缓冲液,混匀后水浴80℃反应2.5h,反应后溶 液装入截止分子量为3k的超滤管,6000r/min离心超滤,并水洗3次,得到牛血清白蛋白-铂 铋纳米复合材料的水溶液。将牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到牛血 清白蛋白-铂铋纳米复合材料粉末。

  实例2:

  在1mL浓度为6.8mmol/L的叶酸水溶液中,加入1mL浓度为40mmol/L的1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺,反应15min后,加入5mL实例1所制备的浓度为4.76mg/ mL的牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液,室温磁力搅拌反应2小时,反应后溶液装入 截止分子量为3k的超滤管,6000r/min离心超滤,并水洗3次,得到叶酸-牛血清白蛋白-铂 铋纳米复合材料水溶液,将叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到叶 酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料粉末。

  实例3:

  在2.79mL浓度为100mmol/L,pH=5的磷酸盐缓冲液中依次加入1mL浓度为2mol/L 的过氧化氢、0.2mL浓度为16mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐、10μL浓度为 4.76mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液,37℃温浴10分钟,溶液由 无色变为蓝色,如图1所示,显色产物在652nm处有吸收峰,表明叶酸-牛血清白蛋白-铂铋 纳米复合材料具有模拟过氧化物酶活性。

  实例4:

  空白对照组:96孔板中每实验孔分别加入200μLRPMI-1640培养液,培养箱中37℃,5% 二氧化碳条件下孵育1.5小时,移除培养液,用浓度为10mmol/L,pH=7.4的磷酸缓冲液轻 轻吹打冲洗3次,每孔依次加入90μL浓度为100mmol/L,pH=5的磷酸盐缓冲液,100μL浓 度为2mol/L的过氧化氢和10μL浓度为16mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐,充 分振荡混匀后,37℃反应15分钟,加入50μL浓度为0.5mol/L的硫酸溶液终止反应,用酶标 仪测定450nm处的吸光度(图2中的a)。

  实例5:

  叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料无细胞对照组:96孔板中每实验孔分别加入 200μL含浓度为0.238mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的RPMI-1640培养 液,培养箱中37℃,5%二氧化碳条件下孵育1.5小时,移除培养液,用浓度为10mmol/L,pH= 7.4的磷酸缓冲液轻轻吹打冲洗3次,每孔依次加入90μL浓度为100mmol/L,pH=5的磷酸 盐缓冲液,100μL浓度为2mol/L的过氧化氢和10μL浓度为16mmol/L的3,3’,5,5’-四甲 基联苯胺盐酸盐,充分振荡混匀后,37℃反应15分钟,加入50μL浓度为0.5mol/L的硫酸溶 液终止反应,用酶标仪测定450nm处的吸光度。如图2中的b所示,叶酸-牛血清白蛋白-铂铋 纳米复合材料无细胞对照组吸光度与空白对照组无显著性差异,表明叶酸-牛血清白蛋白- 铂铋纳米复合材料不会在96孔板中产生非特异性吸附。

  实例6:

  牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人乳腺癌细胞MCF-7组:96孔板中每实验孔分别加入 200μLMCF-7细胞悬液,培养液为含6%胎牛血清的RPMI-1640,培养箱中37℃,5%二氧化碳 条件下培养24小时待完全贴壁,移除培养液,每实验孔分别加入200μL含浓度为0.238mg/ mL的牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的RPMI-1640培养液,培养箱中37℃,5%二氧化碳条 件下孵育1.5小时,移除培养液,用浓度为10mmol/L,pH=7.4的磷酸缓冲液轻轻吹打冲洗3 次,每孔依次加入90μL浓度为100mmol/L,pH=5的磷酸盐缓冲液,100μL浓度为2mol/L 的过氧化氢和10μL浓度为16mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐,充分振荡混匀 后,37℃反应15分钟,加入50μL浓度为0.5mol/L的硫酸溶液终止反应,用酶标仪测定450 nm处的吸光度。如图2中的c所示,牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人乳腺癌细胞MCF-7组 吸光度与空白对照组无显著性差异,表明牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料无法识别人乳 腺癌细胞MCF-7。

  实例7:

  叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人乳腺癌细胞MCF-7组:96孔板中每实验孔分 别加入200μLMCF-7细胞悬液,培养液为含6%胎牛血清的RPMI-1640,培养箱中37℃,5%二 氧化碳条件下培养24小时待完全贴壁,移除培养液,每实验孔分别加入200μL含浓度为 0.238mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的RPMI-1640培养液,培养箱中37 ℃,5%二氧化碳条件下孵育1.5小时,移除培养液,用浓度为10mmol/L,pH=7.4的磷酸缓冲 液轻轻吹打冲洗3次,每孔依次加入90μL浓度为100mmol/L,pH=5的磷酸盐缓冲液,100μ L浓度为2mol/L的过氧化氢和10μL浓度为16mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸 盐,充分振荡混匀后,37℃反应15分钟,加入50μL浓度为0.5mol/L的硫酸溶液终止反应, 用酶标仪测定450nm处的吸光度。如图2中的d所示,叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材 料人乳腺癌细胞MCF-7组吸光度显著高于空白对照组,表明叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米 复合材料能识别人乳腺癌细胞MCF-7。

  实例8:

  叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人乳腺癌细胞MCF-7叶酸封闭组:96孔板中每 实验孔分别加入200μLMCF-7细胞悬液,培养液为含6%胎牛血清的RPMI-1640,培养箱中 37℃,5%二氧化碳条件下培养24小时待完全贴壁,移除培养液,每实验孔分别加入200μL含 0.15mg/mL叶酸的RPMI-1640培养液,培养箱中孵育0.5小时,移除培养液,用浓度为10 mmol/L,pH=7.4的磷酸盐缓冲液轻轻吹打冲洗3次,每实验孔分别加入200μL含浓度为 0.238mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的RPMI-1640培养液,培养箱中37 ℃,5%二氧化碳条件下孵育1.5小时,移除培养液,用浓度为10mmol/L,pH=7.4的磷酸缓冲 液轻轻吹打冲洗3次,每孔依次加入90μL浓度为100mmol/L,pH=5的磷酸盐缓冲液,100μ L浓度为2mol/L的过氧化氢和10μL浓度为16mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸 盐,充分振荡混匀后,37℃反应15分钟,加入50μL浓度为0.5mol/L的硫酸溶液终止反应, 用酶标仪测定450nm处的吸光度。如图2中的e所示,叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材 料人乳腺癌细胞MCF-7叶酸封闭组吸光度与空白组无显著性差异,表明叶酸-牛血清白蛋 白-铂铋纳米复合材料通过细胞表面高表达的叶酸受体识别人乳腺癌细胞MCF-7。

  实例9:

  叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人脐带静脉融合细胞EAhy926组:96孔板中每 实验孔分别加入200μLEAhy926细胞悬液,培养液为含6%胎牛血清的RPMI-1640,培养箱 中37℃,5%二氧化碳条件下培养24小时待完全贴壁,移除培养液,每实验孔分别加入200μL 含浓度为0.238mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的RPMI-1640培养液,培养 箱中37℃,5%二氧化碳条件下孵育1.5小时,移除培养液,用浓度为10mmol/L,pH=7.4的磷 酸缓冲液轻轻吹打冲洗3次,每孔依次加入90μL浓度为100mmol/L,pH=5的磷酸盐缓冲 液,100μL浓度为2mol/L的过氧化氢和10μL浓度为16mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯 胺盐酸盐,充分振荡混匀后,37℃反应15分钟,加入50μL浓度为0.5mol/L的硫酸溶液终止 反应,用酶标仪测定450nm处的吸光度。如图2中的f所示,叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复 合材料人脐带静脉融合细胞EAhy926组吸光度与空白组无显著性差异,表明叶酸-牛血清白 蛋白-铂铋纳米复合材料不能识别表面没有叶酸受体高表达的人脐带静脉融合细胞 EAhy926。

  实例10:

  一种基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料模拟过氧化物酶活性的肿瘤细胞检 测试剂盒:试剂盒中包括提供叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料溶液(a液),3,3’,5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液(b液),过氧化氢溶液(c液),硫酸溶液(终止液)。a液包括含有 浓度为0.238mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的RPMI-1640培养液;b液包 括浓度为16mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐水溶液;c液包括用浓度为100 mmol/L,pH=5的磷酸缓冲液配制的浓度为1.05mol/L的过氧化氢溶液;终止液包括浓度为 0.5mol/L的硫酸溶液。

  实例11:

  一种基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料模拟过氧化物酶活性的肿瘤细胞检 测试剂盒测定叶酸受体高表达的MCF-7细胞:96孔板中每实验孔分别加入200μLMCF-7细 胞悬液,培养液为含6wt%胎牛血清的RPMI-1640,培养箱中37℃,体积分数5%二氧化碳条件 下培养24小时待完全贴壁,移除培养液,每实验孔分别加入200μL实例10的a液,培养箱中 37℃,体积分数5%二氧化碳条件下孵育1.5小时,移除培养液,用浓度为10mmol/L,pH=7.4 的磷酸缓冲液轻轻吹打冲洗3次,每孔依次加入10μL实例10的b液,190μL实例10的c液,充 分振荡混匀后,37℃反应15分钟,加入50μL实例10的终止液,用酶标仪测定450nm处的吸 光度。如图3所示,随着MCF-7细胞数量的增加,显色体系吸光度增大。

  以上所述仅为本发明的典型实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改,等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

  牛血清白蛋白 篇5:

  牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶

  第一、技术领域

  本发明涉及具有模拟过氧化物酶特性的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料,属于纳米技术和仿生技术领域。

  第二、背景技术

  酶是生物体内非常重要,具有催化活性的蛋白质,它催化效率高、专一性强、反应条件温和,生物体的生长、发育、繁殖等生命活动都离不开酶的催化作用。然而天然酶来源有限,提纯困难,价格昂贵。同时,天然酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失去活性,所以在实际应用中对实验的操作条件较为苛刻,使其应用受到了极大的限制。近年来,人工模拟酶的研究开发与应用受到了人们的广泛关注。

  过氧化物酶可以高效地催化氧化过氧化氢,而过氧化氢又是生物反应中一种重要的中间物质,所以对过氧化氢以及相关生化物质的精确测定具有重要的意义。过氧化物模拟酶所涉及的物质包括四氧化三铁纳米粒子,血红蛋白,氯化血红素,金属卟啉,金属酞菁等。其中,纳米人工模拟酶具有制备简单、经济、快捷、耐高温和耐酸碱、性质稳定等诸多优势,在模拟生物酶方面显示出极其诱人的应用前景。

  本发明提供了一种基于牛血清白蛋白-铂复合纳米材料的高活性、高稳定性模拟过氧化物酶。

  第三、发明内容

  本发明的目的是以牛血清白蛋白为模板,通过生物矿化作用,制备牛血清白蛋白-铂复合纳米材料,利用纳米尺度金属铂内核的优良催化特性模拟过氧化物酶及其制备方法和应用,利用牛血清白蛋白外壳对模拟酶活性中心起到稳定作用。

  为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:

  (一)本发明所述的一种牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶,由下述方法制备而成的:在牛血清白蛋白水溶液中加入氯铂酸水溶液,混匀后加入氢氧化钠水溶液得混合溶液,水浴加热,混合溶液在加热反应后其氯铂酸的三个吸收峰消失(此时说明氯铂酸全部反应);将此溶液经过超滤并水洗,得到铂纳米粒子-牛血清白蛋白核壳结构水溶液;模拟过氧化酶活性特征为:在磷酸盐缓冲液中依次加入过氧化氢、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液,混合后温浴,溶液由无色变为蓝色,在652 nm处有一吸收峰。

  本发明上述的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料的制备中的各组分的配比按本领域常规方法可以完成的。但本发明的优选的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料的制备由以下方法制备:在5 ml 50 mg/ml的牛血清白蛋白水溶液中加入16 mmol/L氯铂酸溶液5 ml和1.5 mol/L氢氧化钠溶液0.5 ml,混匀后水浴80 ℃下反应2 h。反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管,6000 r/min离心超滤,并水洗3次。

  模拟过氧化酶活性特征优选测试步骤为:在2780 μL pH=4.5,20 mmol/L的磷酸盐缓冲液中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液,混合后45 ℃温浴10分钟,溶液由无色变为蓝色。

  所述的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液可以通过冷冻干燥得到牛血清白蛋白-铂复合纳米材料粉末。以上过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡,并用双蒸水彻底清洗,晾干。

  本发明所述的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶的制备方法,包括如下步骤:在牛血清白蛋白水溶液中加入氯铂酸水溶液,混匀后加入氢氧化钠水溶液得混合溶液,水浴加热,混合溶液在加热反应后其氯铂酸的三个吸收峰消失;将此溶液经过超滤并水洗,得到铂纳米粒子-牛血清白蛋白核壳结构水溶液。

  (二)本发明的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料的过氧化物酶活性

  本发明所述的一种牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶,能催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色。具体地说,通过牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化过氧化物酶底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐产生蓝色底物,验证和比较其过氧化物酶活性。在磷酸盐缓冲液中依次加入过氧化氢、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液,混合后温浴10分钟,目视观察颜色的变化或测定652 nm波长处的吸光度值(A652)。根据溶液颜色或通过吸光度值标准曲线进行比较过氧化酶活性。

  本发明的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐生成蓝色产物,该产物在652 nm处有最大吸收峰或者牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的活性在pH=4.5、45 ℃时达到最大。

  本发明的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶对3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的米氏常数为0.054 mmol/L,对过氧化氢的米氏常数为14.18 mmol/L。

  本发明的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶在4~95 ℃温度下保存2小时后催化活性均无明显变化,具有良好的稳定性或者在pH 2~12保存2小时后催化活性均无明显变化,具有良好的稳定性。

  本发明的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶在2 mol/L氯化钠溶液中保存2小时后催化活性仍无明显变化,具有良好的稳定性或者具有良好的短期室温稳定性,在24小时内催化活性无明显变化。

  本发明的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶具有良好的短期室温稳定性,在24小时内催化活性无明显变化。具有良好的长期稳定性,在室温下保存30天后,相对催化活性可达到98.9%。

  本发明的优点:

  (1)本发明所使用的制备方法简便快速,无需还原剂。

  (2)本发明中的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料具有良好的过氧化物酶活性。

  (3)本发明中的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料稳定性好,过氧化物酶活性受贮存温度、pH值和离子强度的影响小。

  (4)本发明具有良好的长期稳定性,在室温下保存30天后,相对催化活性可达到98.9%。

  第四、附图说明

  图1为牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的紫外吸收光谱图。

  图2为牛血清白蛋白-铂复合纳米材料终浓度对催化反应体系的影响图。

  图3为pH值对牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响图。

  图4为温浴温度对牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响图。

  图5为牛血清白蛋白-铂复合纳米材料对于3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的稳态动力学曲线图。

  图6为牛血清白蛋白-铂复合纳米材料对于过氧化氢的稳态动力学曲线图。

  图7为保存温度对牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化活性的影响图。

  图8为保存pH值对牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化活性的影响图。

  图9为保存盐浓度对牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化活性的影响图。

  图10为牛血清白蛋白-铂复合纳米材料的短期室温稳定性曲线图。

  第五、具体实施方式

  实例1:

  在5 ml 50 mg/ml的牛血清白蛋白水溶液中加入16 mmol/L氯铂酸溶液5 ml和1.5 mol/L氢氧化钠溶液0.5 ml,混匀后水浴80 ℃下反应2 h。反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管,6000 r/min离心超滤,并水洗3次。超滤后所得溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-铂复合纳米材料粉末。

  实例2:

  在2780 μL磷酸盐缓冲液(pH=4.5,20 mmol/L)中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液,混合后45 ℃温浴10分钟,溶液由无色变为蓝色,在652 nm处有一吸收峰(图1)。

  实例3:

  在2780 μL磷酸盐缓冲液(pH=4.5,20 mmol/L)中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL不同浓度的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液,混合后45 ℃温浴10分钟,测定652 nm波长处吸光度。由图2可见,显色产物的吸光度随着牛血清白蛋白-铂复合纳米材料终浓度增大而增大。

  实例4:

  在2780 μL不同pH值的磷酸盐缓冲液(20 mmol/L)中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液,混合后45 ℃温浴10分钟,测定652 nm波长处吸光度。由图3可见,牛血清白蛋白-铂复合纳米材料的相对催化活性在pH=4.5时达到最大。

  实例5:

  在2780 μL磷酸盐缓冲液(pH=4.5,20 mmol/L)中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液,混合后在不同温度下温浴10分钟,测定652 nm波长处吸光度。由图4可见,牛血清白蛋白-铂复合纳米材料的相对催化活性在温度为45 ℃时达到最大。

  实例6:

  在2780 μL磷酸盐缓冲液(pH=4.5,20 mmol/L)中依次加入1 ml不同浓度的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液,混合后45 ℃温浴1分钟,测定652 nm波长处的吸光度值。通过米氏方程拟合,可以得出牛血清白蛋白-铂复合纳米材料对TMB的米氏常数为0.054 mmol/L(图5)。

  实例7:

  在2780 μL磷酸盐缓冲液(pH=4.5,20 mmol/L)中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml不同浓度的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液,混合后45 ℃温浴1分钟,测定652 nm波长处的吸光度值。通过米氏方程拟合,可以得出牛血清白蛋白-铂复合纳米材料对过氧化氢的米氏常数为14.18 mmol/L(图6)。

  实例8:

  将牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液置于不同温度下保存2小时后,测定保存温度对其相对催化活性的影响。在2780 μL磷酸盐缓冲液(pH=4.5,20 mmol/L)中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液,混合后45 ℃温浴10分钟,测定652 nm波长处的吸光度值。由图7可见,牛血清白蛋白-铂复合纳米材料在4~95 ℃温度下保存2小时后催化活性均无明显变化,具有良好的稳定性。

  实例9:

  将牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液置于不同pH条件下保存2小时后,测定保存温度对其相对催化活性的影响。在2780 μL磷酸盐缓冲液(pH=4.5,20 mmol/L)中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液,混合后45 ℃温浴10分钟,测定652 nm波长处的吸光度值。由图8可见,牛血清白蛋白-铂复合纳米材料在pH 2~12保存2小时后催化活性均无明显变化,具有良好的稳定性。

  实例10:

  将牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液置于不同浓度氯化钠条件下保存2小时后,测定保存温度对其相对催化活性的影响。在2780 μL磷酸盐缓冲液(pH=4.5,20 mmol/L)中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液,混合后45 ℃温浴10分钟,测定652 nm波长处的吸光度值。由图9可见,牛血清白蛋白-铂复合纳米材料在高达2 mol/L氯化钠溶液中保存2小时后催化活性仍无明显变化,具有良好的稳定性。

  实例11:

  将牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液置于室温下保存不同时间后,测定其相对催化活性。在2780 μL磷酸盐缓冲液(pH=4.5,20 mmol/L)中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液,混合后45 ℃温浴10分钟,测定652 nm波长处的吸光度值。由图10可见,牛血清白蛋白-铂复合纳米材料具有良好的短期室温稳定性,在24小时内催化活性无明显变化。

  实例12:

  将牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液置于室温下保存30天后,测定其相对催化活性。在2780 μL磷酸盐缓冲液(pH=4.5,20 mmol/L)中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液,混合后45 ℃温浴10分钟,测定652 nm波长处的吸光度值。结果表明牛血清白蛋白-铂复合纳米材料具有良好的长期稳定性,在室温下保存30天后,相对催化活性可达到98.9%。

  以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改,等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

  牛血清白蛋白 篇6:

  牛血清白蛋白包覆金纳米粒子的制备方法

  第一、技术领域

  本发明涉及纳米材料领域,为纳米复合粒子的合成方法,尤其涉及一种牛血清白蛋白包覆金纳米粒子的制备方法。

  第二、背景技术

  近年来,金纳米粒子(包括金纳米壳、金纳米笼、金纳米棒、金纳米星、多边形金纳米粒子,等)在生物医学方面得到了广泛的关注和研究。金纳米粒子拥有特殊的光电性质,是一种具有重要生物医学应用前景的纳米生物医学材料。

  上述具有特殊结构的金纳米粒子(如金纳米棒)具有强烈的表面等离子共振效应,在光束的照射下能将光能高效地转化成热能,因此,在医学领域,金纳米粒子可以用作肿瘤的光热治疗。此外,金纳米粒子还可以作为其它治疗药物的运送载体,也可以用于生物成像(如光声成像)。可以说,金纳米粒子在生物医学上的应用十分广泛。

  然而,一种治疗方式对肿瘤的生长抑制效果是有限的,如单独使用金纳米粒子对肿瘤进行热疗,其效果不及热化疗(热疗+化疗)。实际上,临床上对于肿瘤的治疗,多采用多种模式的综合治疗,也就是多模治疗。鉴于此,本发明通过溶剂转换的方法在金纳米粒子表面包覆牛血清白蛋白,牛血清白蛋白壳层中能装载大量的药物,该药物发挥的作用(如化疗、光动力治疗,等)将与金纳米粒子的光热效应协同高效摧毁肿瘤细胞。

  第三、发明内容

  本发明所要解决的技术问题在于提供一种简便快捷的牛血清白蛋白(BSA)包覆金纳米粒子的制备方法。

  本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是一种牛血清白蛋白包覆金纳米粒子的制备方法,包括下述步骤:

  1) 金纳米粒子水溶液中加入牛血清白蛋白,金纳米粒子与牛血清白蛋白的质量比为1:(1~5);

  2) 一边超声波振荡一边向上述溶液中缓慢滴加0.5~2倍体积的有机溶剂,继续超声波振荡,制得牛血清白蛋白包覆金纳米粒子。

  所述的超声波振荡过程在0.5小时以上,制得牛血清白蛋白包覆金纳米粒子。

  所述金纳米粒子与牛血清白蛋白的质量比优选为1:(1.5~4)。

  在上述方案的基础上,所述的金纳米粒子可以为金纳米球、金纳米棒、金纳米笼和金纳米壳中的一种或多种的组合。且所用的金纳米粒子可以采用现有的各种方法制备。

  在上述方案的基础上,步骤1)中,所述金纳米粒子水溶液的浓度为0.5~2 mg/ml。

  在上述方案的基础上,所述的有机溶剂为无水乙醇、乙二醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、丙二醇、丙三醇、丙酮、四氢呋喃的一种或几种的组合。

  在上述方案的基础上,滴加完有机溶剂后,再加入少量的1%戊二醛水溶液,超声波振荡。

  本发明的牛血清白蛋白包覆金纳米粒子的制备方法可以包含戊二醛水溶液的加入步骤,以进一步提高牛血清白蛋白的包覆持久性。

  在上述方案的基础上,所述1%戊二醛水溶液的加入量为5~100μL。

  所述1%戊二醛水溶液的加入量优选为20~80μL。

  本发明的有益效果是:

  采用本发明的方法能够成功制备牛血清白蛋白包覆的金纳米粒子,并且快捷高效。

  第四、附图说明

  图1为金纳米粒子(金包硒化金,即Au/AuSe)的透射电镜照片。

  图2为牛血清白蛋白包覆金纳米粒子(BSA/Au/AuSe)的透射电镜照片。

  图3为牛血清白蛋白包覆金纳米粒子(BSA/Au/AuSe)的扫描电镜照片。

  图4为金纳米粒子(金纳米星)的透射电镜照片。

  图5为牛血清白蛋白包覆金纳米粒子(BSA/金纳米星)的透射电镜照片。

  第五、具体实施方式

  实施例1

  金纳米粒子(Au/AuSe)的制备(金纳米壳)

  向10ml水中搅拌滴加1000μL 25mM的氯金酸水溶液,200μL 29mM的二氧化硒溶液,1000μL 0.2M的碳酸钾溶液;继续缓慢滴加3.0mL 1.0mg/mL的硼氢化钠溶液,溶液由紫红色变为深咖啡色;继续搅拌10min,制得如图1所示的金纳米粒子(Au/AuSe)。

  牛血清白蛋白包覆金纳米粒子的制备

  1) 向2 ml金纳米粒子水溶液(浓度0.5 mg/ml)中加入4mg的牛血清白蛋白(金纳米粒子与牛血清白蛋白质量比1:4);

  2) 一边进行超声波振荡处理一边缓慢滴加2 ml无水乙醇(上述溶液1倍体积),继续超声波振荡1h;

  3) 滴加40μL的1%戊二醛溶液,继续超声波振荡1h,制得牛血清白蛋白包覆金纳米粒子。

  使用透射电镜和扫描电镜表征金纳米粒子和BSA/金纳米粒子的形貌。由图1可看出金纳米粒子在透射电镜下显示为10nm左右的衬度很高的黑点,图2则表明金纳米粒子已经被包埋在BSA中,并且包埋率比较高,整个BSA/金纳米粒子大小在200nm左右。图3的扫描电镜照片显示出BSA/金纳米粒子以球形为主且大小比较均匀。

  实施例2

  金纳米粒子的制备与实施例1相同

  牛血清白蛋白包覆金纳米粒子的制备

  1) 向2 ml金纳米粒子水溶液(浓度0.5 mg/ml)中加入2.4 mg的牛血清白蛋白(金纳米粒子与牛血清白蛋白质量比1:2.4);

  2) 一边进行超声波振荡处理一边缓慢滴加3 ml甲醇(上述溶液1.5倍体积),超声波振荡1.5 h,制得牛血清白蛋白包覆金纳米粒子。

  实施例3

  金纳米粒子的制备与实施例1相同

  牛血清白蛋白包覆金纳米粒子的制备

  1) 向2ml金纳米粒子水溶液(浓度1 mg/ml)中加入2 mg的牛血清白蛋白(金纳米粒子与牛血清白蛋白质量比1:1);

  2) 一边进行超声波振荡处理一边缓慢滴加4 ml无水乙醇(上述溶液2倍体积),继续超声波振荡1h;

  3) 滴加20μL的1%戊二醛溶液,继续超声波振荡1h,制得牛血清白蛋白包覆金纳米粒子。

  实施例4

  牛血清白蛋白包覆金纳米粒子的制备

  1) 向2 ml金纳米粒子水溶液(浓度0.5 mg/ml)中加入2 mg的牛血清白蛋白(金纳米粒子与牛血清白蛋白质量比1:2);

  2) 一边进行超声波振荡处理一边缓慢滴加1.5ml无水乙醇(上述溶液0.75倍体积),继续超声波振荡1h;

  3) 滴加80 μL的1%戊二醛溶液,继续超声波振荡1h,制得牛血清白蛋白包覆金纳米粒子。

  实施例5

  金纳米粒子的制备(金纳米星)

  将20ml正己醇,30ml triton x-100,100ml环己烷缓慢搅拌混合得到微乳,边搅拌边向微乳中缓慢滴加5ml 20mM的氯金酸水溶液,搅拌1h后再向微乳中滴加 50ul 5%的羟胺水溶液,微乳由金色变为黑色,继续搅拌1h,离心得到沉淀,乙醇洗涤3次,去离子水洗涤3次,制得如图4所示的金纳米星。

  牛血清白蛋白包覆金纳米粒子的制备

  1) 向2 ml金纳米星水溶液(浓度2 mg/ml)中加入6 mg的牛血清白蛋白(金纳米粒子与牛血清白蛋白质量比1:1.5);

  2) 一边进行超声波振荡处理,一边缓慢滴加3ml甲醇(上述溶液1.5倍体积),继续超声波振荡1.5 h,制得牛血清白蛋白包覆金纳米星。

  图5表明金纳米星已经被包埋在牛血清白蛋白中。

  牛血清白蛋白 篇7:

  一种牛血清白蛋白检验装置

  第一、技术领域

  本实用新型涉及生物制品检验技术领域,具体而言,涉及一种牛血清白蛋白检验装置。

  第二、背景技术

  牛血清白蛋白是牛血清中的一种球蛋白,包含607个氨基酸残基,其分子量为66.446kDa并且其等电点为4.7,目前生物制品生产普遍采用牛血清作为细胞培养的主要成分,但是由于它对人体是一种异源蛋白,注射后可能会引发过敏性休克等不良反应,目前已经有报道的过敏成分主要是牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)和牛血清IgG(BovineImmunoglobulin G,B-IgG),为了有效控制过敏原含量,《中国药典》第三部中规定疫苗中牛血清白蛋白残留量不得超过50ng/ml,但是现有的检验工序繁杂,检验时间较长,检验时间过长容易减低生物制品的活性,难以满足需求,因此如何能够快速准确地检验生物制品中牛血清白蛋白的残留成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

  第三、实用新型内容

  本实用新型旨在至少解决现有技术或相关技术中存在的技术问题之一,提供了一种牛血清白蛋白检验装置,该装置能够快速准确地检验生物制品中牛血清白蛋白的残留,从而提高生物制品的安全性。

  本实用新型公开了一种牛血清白蛋白检验装置,从上到下依次包括样品垫、胶体金标记垫、检测反应区、吸水垫以及底板,胶体金标记垫吸附有抗牛血清白蛋白,检测反应区设有硝酸纤维素膜,硝酸纤维素膜的两侧分别设有包被有牛血清白蛋白的检测线以及兔抗牛血清印制的质控线。

  根据上述技术方案,优选地,包被有牛血清白蛋白为牛血清白蛋白标准品。

  根据上述技术方案,优选地,样品垫材质为玻璃纤维棉。

  根据上述技术方案,优选地,胶体金标记垫材质为尼龙膜。

  根据上述技术方案,优选地,检测反应区材质为硝酸纤维素膜。

  根据上述技术方案,优选地,吸水垫材质为吸水滤纸。

  根据上述技术方案,优选地,底板由PVC材料制成。

  该试纸的工作原理为:采用胶体金免疫层析技术,当待检样品中含有牛血清白蛋白时,在吸水垫的牵引下由于毛细血管作用牛血清白蛋白先和尼龙膜上胶体金标记的兔抗牛血清白蛋白抗体结合形成复合物,然后复合物通过层析作用向前移动,上行到检测线时,遇到羊抗兔血清,形成二抗、一抗结合一个蛋白的金标复合物,因有金颗粒在此沉积,聚集在检测带上,故检测线显红色,可通过肉眼观察到显色结果。

  本实用新型的试纸使用方法:取生物制品终产品以300g,离心5min,取100-150ul上清液,滴加到制备的试纸的样品垫上,15-20分钟判读结果:如样品中含有牛血清白蛋白,则其经过胶体金标记垫时,会与兔抗牛血清白蛋白抗体结合,进而被检测线上的羊抗兔血清捕获,聚集在检测带上形成红色的沉淀,即为阳性,反之则为阴性。

  本实用新型的有益效果体现在:由于牛血清白蛋白残留量是判定生物制品是否合格的关键指标,《中国药典》规定的酶联免疫检测法用时较长,通过胶体金免疫层析法可以快速检测生物制品中牛血清白蛋白残留量是否合格,本方法可以直接快速的检测牛血清白蛋白残留量是否合格,不需专业培训,操作方便,快速,适合生物制品研发及生产使用。

  第四、附图说明

  图1示出了根据本实用新型的实施例的立体结构示意图。

  图中:1.样品垫,2.胶体金标记垫,3.检测反应区,4.吸水垫,5.底板,6.检测线,7.质控线。

  第五、具体实施方式

  在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本实用新型,但是,本实用新型还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施,因此,本实用新型并不限于下面公开的具体实施例的限制。

  如图所述,本实用新型的实施例提供了一种牛血清白蛋白检验装置,从上到下依次包括样品垫1、胶体金标记垫2、检测反应区3、吸水垫4以及底板5,胶体金标记垫2吸附有抗牛血清白蛋白,检测反应区3设有硝酸纤维素膜,硝酸纤维素膜的两侧分别设有包被有牛血清白蛋白的检测线6以及兔抗牛血清印制的质控线7,本实用新型采用胶体金免疫层析技术,当待检样品中含有牛血清白蛋白时,在吸水垫的牵引下由于毛细血管作用牛血清白蛋白先和尼龙膜上胶体金标记的兔抗牛血清白蛋白抗体结合形成复合物,然后复合物通过层析作用向前移动,上行到检测线时,遇到羊抗兔血清,形成二抗、一抗结合一个蛋白的金标复合物,因有金颗粒在此沉积,聚集在检测带上,故检测线6显红色,可通过肉眼观察到显色结果,从而实现了快速的检测牛血清白蛋白残留量是否合格,提高使用者的安全性。

  根据上述实施例,优选地,包被有牛血清白蛋白为牛血清白蛋白标准品,增强检测结果的准确性。

  根据上述实施例,优选地,样品垫1的材质为玻璃纤维棉,能够增强吸附性和渗透性。

  根据上述实施例,优选地,胶体金标记垫2的材质为尼龙膜,便于吸附兔抗牛血清白蛋白抗体,提高与牛血清白蛋白的反应速度。

  根据上述实施例,优选地,检测反应区3的材质为硝酸纤维素膜,其表面较为光滑,便于分子的移动,提高检验准确性。

  根据上述实施例,优选地,吸水垫4的材质为吸水滤纸,便于吸收检测液体中的水分,提高反应速度和准确性。

  根据上述实施例,优选地,底板5由PVC材料制成,存在一定强度并且能够保证不渗水,能够有效保持检测环境的整洁。

  本实用新型的试纸使用方法:取生物制品终产品以300g,离心5min,取100-150ul上清液,滴加到制备的试纸的样品垫上,15-20分钟判读结果:如样品中含有牛血清白蛋白,则其经过胶体金标记垫时,会与兔抗牛血清白蛋白抗体结合,进而被检测线上的羊抗兔血清捕获,聚集在检测带上形成红色的沉淀,即为阳性,反之则为阴性。

  本实用新型的有益效果体现在:本方法可以直接快速的检测牛血清白蛋白残留量是否合格,本实用新型的检测试纸条具有较高的灵敏度和特异性,不需专业培训,操作方便,快速,适合生物制品研发及生产使用,非常适合研发生产应用。

  以上所述仅为本实用新型的优选实施例而已,并不用于限制本实用新型,对于本领域的技术人员来说,本实用新型可以有各种更改和变化。凡在本实用新型的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本实用新型的保护范围之内。

《牛血清白蛋白 (内容集合7篇).doc》
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