一种罗伊氏短芽孢杆菌ZJB19162及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种罗伊氏短芽孢杆菌ZJB19162及其在混凝土裂缝修复中的应用。
背景技术
混凝土因其抗压强度高，延展性好，价格低廉被广泛应用于建筑材料中，但传统水泥建筑在使用一段时间之后，由于塑性收缩，热应力，沉降，干燥收缩，风化，自然侵蚀、钢筋腐蚀，或由于施加负荷等多种因素的作用，混凝土会出现微开裂或局部损伤，这将影响其力学性能和耐久性能，进而影响其正常使用及服役寿命，其内部钢筋亦会暴露出来而被腐蚀，给建筑带来安全隐患。
传统的修复技术是使用人造高分子材料修补裂缝，虽然在一定程度上能有效修复微裂缝，但存在修复时间长、效果不佳、修复过程难以调控等问题。
目前的一种新型修复技术为在水泥中添加能够适应碱性环境并可进行生物矿化的微生物孢子，一旦有裂缝出现，就会激活该种微生物并利用乳酸钙作为钙源进行生物矿化，从而修补裂缝。
如De Muynck等利用球形芽孢杆菌，将石灰试件放入含有尿素和氯化钙的矿化培养基中进行矿化沉积试验，5d后在石灰试件裂缝表面有检测到50μm菱形方解石晶体生成，试件整体重量增加0.3-1.1g，与未处理的石灰试件相比，水渗透性明显下降(Influence ofurea and calcium dosage on the effectiveness of bacterially induced carbonateprecipitation on limeston.Ecological Engineering,2010,36(2)：99-111)。
专利文献CN 104403959A公开了一种高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.H4，该菌种能够在低细胞浓度下(5×107个/ml)对钙离子进行转化，矿化作用在20-37℃、pH9.0-11.0下进行，钙矿化率高达96.4％。
利用微生物诱导碳酸钙沉积实现对混凝土裂缝的修复既节约了能源，也减少了碳的排放，无疑是一种环境友好型的修复技术，因此，开发一种更高效的混凝土裂缝自修复生物制剂对微生物和建筑材料交叉技术领域具有积极意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效的钙离子矿化细菌，其代谢产物可与环境中的钙离子高效结合形成方解石，用于修复混凝土微裂缝，为混凝土自修复生物制剂的开发提供新的理论依据和技术支持。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明从浙江工业大学朝晖校区古运河边的土样中分离得到具有高脲酶活力的菌株ZJB19162，提取所述的菌株ZJB19162的16S rDNA片段，扩增16S rDNA片段，测得的16S序列如SEQ ID NO.1所示。将所测得的16S序列在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库进行比对，ZJB19162与已知菌株Brevibacillus reuszeri strain NBRC 15719聚类于同一分支，亲缘关系最近，相似度高达99.93％，从而确定了ZJB19162在分类上属于罗伊氏短芽孢杆菌(Brevibacillus reuszeri)，将其命名为罗伊氏短芽孢杆菌ZJB19162(Brevibacillusreuszeri ZJB19162)。
本发明提供了一种罗伊氏短芽孢杆菌ZJB19162，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉、武汉大学，保藏日期：2020年1月13日，保藏编号：CCTCC NO:M 2020045。
本发明还提供了所述的罗伊氏短芽孢杆菌ZJB19162在混凝土裂缝修复中的应用。
所述应用可以为将菌体添加至混凝土微裂缝进行的被动修复，具体地：将罗伊氏短芽孢杆菌ZJB19162菌体与含有钙盐和尿素的营养液混合，再将混合液加到混凝土裂缝中，养护至混凝土裂缝修复完成。
作为优选，所述营养液为每升水中加入蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，CaCl2 7～27g，尿素5～14g，pH值为7.0～7.2。更为优选，所述营养液为每升水中加入蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，CaCl222g，尿素12g，pH7.0-7.2。
作为优选，混合液中罗伊氏短芽孢杆菌ZJB19162菌体的浓度为1×107cfu/mL～1×109cfu/mL。
所述应用也可以为在混凝土制备过程中直接将芽孢混入，当出现裂缝时，芽孢被激活快速萌发成营养体完成对混凝土裂缝的自修复。具体地：将罗伊氏短芽孢杆菌ZJB19162芽孢与包含钙盐和尿素的混合营养液混合得到菌剂，再将菌剂代替混凝土制备过程中的水，拌制后经标准养护得到自修复混凝土。
主动修复需要考虑营养添加物对混凝土机械性能的影响，作为优选，所述混合营养液成分包括酵母提取物、肌苷、乳酸钙和尿素，浓度分别为1～2g/L、2～3g/L、20～25g/L和8～14g/L。更为优选，混合营养液中酵母提取物、肌苷、乳酸钙和尿素的浓度分别为1.5g/L、2.68g/L、20.8g/L和10g/L。
作为优选，所述菌剂中罗伊氏短芽孢杆菌ZJB19162芽孢的浓度为4×107cfu/mL～1×109cfu/mL。
本发明还提供了一种混凝土裂缝自修复生物制剂，包括所述的罗伊氏短芽孢杆菌ZJB19162。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种罗伊氏短芽孢杆菌ZJB19162，该菌株从浙江工业大学朝晖校区古运河边的土样中分离获得，其代谢产物可与环境中的钙离子高效结合形成方解石，可有效修复混凝土微裂缝。此外，菌株ZJB19162具有很好的热稳定性和酸碱稳定性，作为混凝土裂缝修复应用时可以适应不同酸碱度环境。菌株ZJB19162具有作为生物修复制剂进行混凝土裂缝自修复的潜力和应用前景。
附图说明
图1为实施例3中添加罗伊氏短芽孢杆菌ZJB19162的实验组沉淀物的扫描电镜图。
图2为实施例3中未添加菌的对照组的沉淀物扫描电镜图。
图3为实施例3实验组矿化沉淀物的能谱分析结果，其中(A)为能谱图，(B)为组分分析结果。
图4为实施例3对照组矿化沉淀物的能谱分析结果，其中(A)为能谱图，(B)为组分分析结果。
图5为实施例4中菌株ZJB19162被动修复混凝土微裂缝的结果图，其中“8号”为添加ZJB19162的试验组，“空”作为只添加等量的营养液不添加菌体的对照组。
图6为实施例9中菌株ZJB19162主动修复混凝土微裂缝的结果图。
图7为实施例10中菌株ZJB19162主动修复混凝土微裂缝的结果图。
图8为实施例11中菌株ZJB19162主动修复混凝土微裂缝的结果图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中培养基配方如下：
产脲酶菌株筛选培养基成分为：蛋白胨1g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2g/L，尿素2g/L，葡萄糖0.1g/L，酚红溶液(0.2％)4ml/L，20g/L琼脂，pH值为7。其中，尿素和葡萄糖分别单独配制为溶液灭菌。
LB培养基成分为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0-7.2。
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌20min。
实施例1适配混凝土自修复菌剂制备的菌株筛选与鉴定
1)取浙江工业大学朝晖校区古运河边的土样1g加入到已灭菌的带有小玻璃珠和100mL无菌水的锥形瓶中，30℃，200r/min震荡30min后静置10min，去除底部沉淀物，得到土壤悬浮液。将土壤悬浮液置于100℃水中进行沸水浴加热3-5min，得到土壤样品原液。
在超净台中进行土壤样品原液的梯度稀释，浓度梯度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，吸取200μL各浓度的菌悬液接种于产脲酶菌株筛选培养基平板上，用封口膜将平板封口后倒置，放于37℃恒温培养箱中培养24h，在菌落数合适的平板上，通过观察菌落边缘红色深浅，取边缘红色深的典型菌落，经过分离纯化后，接种至LB培养基中，培养24h后，取适量菌液用30％的甘油保藏于-80℃冰箱里；取部分菌液进行生理生化和分子生物学鉴定。
2)用FastDNATM Spin Kit for Soil试剂盒提取菌株基因组DNA，以此为模板，进行PCR扩增，细菌通用引物：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'，
1492R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。
PCR程序：在95℃进行预变性5min；95℃40s，55℃30s，72℃2min，30个循环延伸；72℃10min。产物由擎科生物技术有限公司进行PCR产物测序，将获得的DNA序列，输入GenBank，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比对，选择合适的DNA序列建立系统发育树，确定筛选获得菌株的种属。
3)筛选获得18株新的菌株(先后筛选到，并非一次性筛选获得)，将分离得到的单一菌落接种到芽孢形成培养基中，于30℃摇床振荡培养24h，随后取2ml的培养液4℃，12000r/min离心3min，去掉上清得到菌体测定脲酶酶活。脲酶活性测定采用靛酚蓝比色法，活力定义：在37℃条件下每产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。以U表示。筛选过程中，部分菌株酶活如表1所示。
表1
最终从18株菌株中筛选得到一株高脲酶活力的罗伊氏短芽孢杆菌ZJB19162，测得的16S序列如SEQ ID NO.1所示。将所测得的16S序列在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库进行比对，该菌株与已知菌株Brevibacillus reuszeri strain NBRC 15719聚类于同一分支，亲缘关系最近，相似度高达99.93％，从而确定了ZJB19162在分类上属于罗伊氏短芽孢杆菌(Brevibacillus reuszeri)。因此对该菌株进行命名并保藏，命名为罗伊氏短芽孢杆菌ZJB19162(Brevibacillus reuszeri ZJB19162)，2020年1月13日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏中心于2020年1月28日检测为存活，保藏号为CCTCCNO:M 2020045。
实施例2不同条件对菌株ZJB19162脲酶酶活的影响
1)热稳定性
因混凝土浇筑中的水化过程放热会使温度升高至40℃以上，因此将浓度为10mg/mL的菌株ZBL19162菌悬液分别进行40、45、50、55、60℃水浴处理60min，待其冷却后，利用血球计数板对染色后的菌悬液计数，计算出活细胞与死细胞的比率。菌株ZJB19162在60℃以下时，的存活率仍保持在93％以上，说明菌株ZJB19162的热稳定性较好。
2)碱稳定性
因混凝土浇筑中的水化过程会使pH处于12-13之间，因此将浓度为10mg/mL的菌株ZBL19162菌悬液用1mol/L的氢氧化钠将pH值调节为12.5，静置24h后，溶液经0.22μm的微孔滤膜抽滤，以未调节pH值的溶液作为对照，利用血球计数板对染色后的菌悬液计数，在pH为12.5时，菌株ZJB19162存活率仍保持在82％以上，这说明菌株ZJB19162的碱稳定性较好。
实施例3菌株ZJB19162的代谢物与环境中的钙离子相结合产生方解石
将菌株ZJB19162接种于装瓶量为200mL的LB液体培养基中，放置于37℃培恒温摇床中150r/min振荡培养12h。发酵液4℃，8000r/min下离心10min后获得菌体。将离心得到的菌体添加至含有LB液体培养基、15g/L氯化钙和10g/L尿素的混合液中，三者的体积比为2:1:1。混合均匀后置于37℃培养间静置培养，以未加菌的混合液作为对照组。
7d后肉眼观察底部表面沉淀物的产生情况，并将沉淀物离心后置于80℃烘箱中烘干再置于扫描电子显微镜下观察，同时对固体颗粒进行能谱测试，其结果如下：
1)加菌组经过养护之后微生物表面形成矿化沉淀物，如图1所示。分析能谱结果，此固体只有钙离子，氯离子极其微弱，可推测为碳酸钙，如图3所示，即矿化菌于混凝土环境中可产生碳酸钙沉淀，实现混凝土裂纹的愈合。
2)未加菌组的扫描电镜结果可以看出，该区域并没有菌体附着，如图2所示。能谱含有钙离子与氯离子，如图4所示，且该实验材料为没有添加菌体的对照组，因此认为其为氯化钙的沉积。
实施例4菌株ZJB19162被动修复混凝土微裂缝
按照标准程序借助小铁片通过预制裂缝法制备含有长×宽×深为15mm×0.3mm×20mm微裂缝的标准混凝土试件并用保鲜膜包裹好后静置于室温中，对应裂缝标记为“空”、“8号”，其中组别“8号”为ZJB19162菌液与营养液混合液，组别“空”作为只添加等量的营养液不添加菌体的对照组。每组3条裂缝，间隔注射至混凝土裂缝中，观察表面愈合情况，同时对渗透时间进行计时，间接表明裂缝修复效能。其中所述的营养液成分为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，CaCl2 7g，尿素5g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2。所述菌浓为3×107cfu/ml。
如图5所示，4d后，组别“8号”的裂缝大部分已被填满，而组别“无”裂缝未愈合。此外，表2表明添加菌体能有效延长完全渗透时间。以上结果说明菌株ZJB19162可实现混凝土微裂缝的修复。
表2
实施例5菌株ZJB19162修复混凝土微裂缝最适营养液
本实施例同实施例4，不同的是本实施例中混凝土裂缝自修复的营养液包括如下重量份成分：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，CaCl212g，尿素8g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2。
测定的指标为5d后观察裂缝愈合情况，第一次完全渗透时间超过50min的修复时间。结果见表3。
实施例6
本实施例同实施例5，不同的是本实施例中混凝土裂缝自修复的营养液包括如下重量份成分：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，CaCl217g，尿素10g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2。
实施例7
本实施例同实施例5，不同的是本实施例中混凝土裂缝自修复的营养液包括如下重量份成分：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，CaCl222g，尿素12g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2。
实施例8
本实施例同实施例5，不同的是本实施例中混凝土裂缝自修复的营养液包括如下重量份成分：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，CaCl227g，尿素14g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2。
表3
如表3所示，本发明提出的混凝土修复营养液的修复效果较好，且大大降低裂缝的渗水能力，且实施七为最佳实施例。
实施例9菌株ZJB19162芽孢主动修复混凝土微裂缝
分别称量离心的菌体芽孢(菌浓为4×107cfu/ml)与混合营养成分混合均匀得到菌剂。按照标准程序，将菌剂代替混凝土试件制备过程中的水，借助小铁片通过预制裂缝法制备含有长×宽×高为35mm×0.5mm×15mm微裂缝的标准混凝土试件，并用保鲜膜包裹好后静置于30℃、湿度90％的恒温恒湿培养箱中进行养护。观察其微裂缝的愈合率和渗水率。其中所述的营养液成分为：酵母提取物，肌苷，乳酸钙和尿素，浓度分别为1.5g/L，2.68g/L，20.8g/L和10g/L。养护28天后，观察铁片周围维裂缝愈合情况，结果如图6所示。
实施例10
本实施例同实施例9，不同的是本实施例中混凝土裂缝自修复的菌浓为4×108cfu/ml。结果如图7所示。
实施例11
本实施例同实施例9，不同的是本实施例中混凝土裂缝自修复的菌浓为1×109cfu/ml。结果如图8所示。
从图6-图8显示实施例9-11的裂缝大部分已经愈合，这表明菌株ZJB19162芽孢具备主动修复混凝土微裂缝的能力。其中实施例11为最佳实施例，这说明混凝土裂缝自修复的最优菌浓为1×109cfu/ml。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种罗伊氏短芽孢杆菌ZJB19162及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1410
<212> DNA
<213> 罗伊氏短芽孢杆菌(Brevibacillus reuszeri)
<400> 1
cttcggcggc tggctccttg cggttacctc accgacttcg ggtgttgcaa actcccgtgg 60
tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120
ttactagcga ttccgacttc atgtaggcga gttgcagcct acaatccgaa ctgagattgg 180
ttttaagaga ttggcatacc ctcgcgggct agcgtcccgt tgtaccaacc attgtagcac 240
gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccgcc ttcctccgtc 300
ttgtcgacgg cagtctctct agagtgccca actgaatgct ggcaactaaa gataagggtt 360
gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc 420
acctgtcacc gctgccccga agggaagctc tgtctccaga gcggtcagcg ggatgtcaag 480
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cccccgtcaa ttcctttgag tttcactctt gcgagcgtac tccccaggcg gagtgcttat 600
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gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcgc ctcagcgtca 720
gttacagacc agaaagccgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac 780
cgctacacgt ggaataccgc tttcctcttc tgcactcaag ctacacagtt tccgatgcga 840
accggagttg agctccgggc tttaacacca gacttacata gccgcctgcg cgcgctttac 900
gcccaataaa tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt 960
tagccgtggc tttctcgtca ggtaccgtca aggtaccgcc ctattcgaac ggtacttatt 1020
cgtccctaac aacagaactt tacaatccga agaccttcat cgttcacgcg gcgttgctcc 1080
atcagacttt cgtccattgt ggaaaattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc 1140
gtgtctcagt cccagtgtgg ccggtcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg 1200
taggccgtta ccccaccaac tagctaatgc gccgcaggcc catctcccag tgatagccga 1260
agccatcttt tcttttcgga ccatgcggtc caaaaaccta tccggtatta gcataagttt 1320
ccctatgtta tcccagtctg agaggcaggt tgcctacgtg ttactcaccc gtccgccgct 1380
agcctccgaa gagactcgct cgactgcatg 1410
