一种硫二甘醇分子印迹聚合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种硫二甘醇分子印迹聚合物及其制备方法和应用。
背景技术
芥子气是一种被广泛应用到军事上的一种化学战剂，由于芥子气的高毒性可以使对手丧失战斗力，因此被称为“战争之王”和“现代战术战争中的首选化学武器”。芥子气分子基于分子内环化作用，自发形成高反应性和不稳定的中间体，并产生毒性。芥子气是强烷基化剂，可以与生物介质中存在的各种游离亲核位点快速反应，并具有诱变、致癌和细胞毒性作用。芥子气不仅对皮肤、眼睛和肺部造成直接损害，也会引起染色体损害，尤其是对长期可能接触到芥子气的人。芥子气至今没有特效抗毒药物，仅能采取对症治疗措施。在进入人体后，芥子气容易水解为相对稳定、低挥发性和低毒性的代谢产物硫二甘醇(TDG)。因此，通过检测TDG可以判断是否为芥子气中毒，为临床诊断提供依据。
现有检测TDG的方法主要包括液相色谱-质谱联用(LC-MS)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)。其中，LC-MS可以最方便地分析TDG，但该方法不适用于生物医学样品的痕量分析。TDG也可以利用GC-MS分析，但峰形并不理想，分析浓度低于1ppm时需要进行衍生化，而且需要将TDG修饰为挥发性更高和极性较小的衍生物，才能通过GC-MS进行定量和定性分析。这些检测手段不仅需要昂贵的仪器和试剂，还需要专业人员进行操作，很难实现对TDG的现场即时检测。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种硫二甘醇分子印迹聚合物的制备方法；目的之二在于提供一种硫二甘醇分子印迹聚合物；目的之三在于提供硫二甘醇分子印迹聚合物在检测芥子气中毒标志物硫二甘醇中的应用；目的之四在于提供用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸；目的之五在于提供用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸的制备方法；目的之六在于提供利用该试纸检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种硫二甘醇分子印迹聚合物的制备方法，所述方法如下：
将α-甲基丙烯酸加入硫二甘醇溶液中，超声混匀后加入N,N-二甲基亚甲基双丙烯酰胺，混匀后加入过硫酸铵，35-40℃下超声处理后获得中间产物，最后洗去所述中间产物中的硫二甘醇，取固相干燥后制得硫二甘醇分子印迹聚合物。
优选的，所述α-甲基丙烯酸、硫二甘醇、N,N-二甲基亚甲基双丙烯酰胺和过硫酸铵的摩尔质量比为2:1:0.08:0.05，mol:mol:mg:mg。
优选的，所述超声混匀的时间为10-30min；所述混匀为超声处理30min以上；所述超声处理的时间为1h以上。
优选的，洗去所述中间产物中的硫二甘醇的方法如下：将所述中间产物浸泡在氯仿中，超声处理10min后，置于摇床上摇匀50min，摇匀期间以新的氯仿置换前次氯仿，置换2-3次。
优选的，所述干燥为在30-50℃下干燥至恒重。
2、由所述的方法制备的硫二甘醇分子印迹聚合物。
3、所述的硫二甘醇分子印迹聚合物在检测芥子气中毒标志物硫二甘醇中的应用。
4、用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸，所述试纸为包被有所述的硫二甘醇分子印迹聚合物的硝酸纤维素膜。
5、所述的用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸的制备方法，所述方法如下：
将α-甲基丙烯酸加入硫二甘醇溶液中，超声混匀后加入N,N-二甲基亚甲基双丙烯酰胺，混匀后加入过硫酸铵，并将硝酸纤维素膜浸泡于其中，35-40℃下超声处理后，取出所述硝酸纤维素膜并浸泡于氯仿中，超声处理10min后，置于摇床上摇匀50min，摇匀期间以新的氯仿置换前次氯仿，置换2-3次，最后取出干燥，即可。
6、利用所述的试纸检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的方法，所述方法如下：
将所述试纸浸泡于含有硫二甘醇的待测液中15min后，取出清洗至去除所述试纸上的非模板分子，室温下放置5min后，于30℃下浸泡于金纳米颗粒溶液中50min，取出后根据所述试纸呈现的颜色进行定性分析和定量分析。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种硫二甘醇分子印迹聚合物及其制备方法和应用，在制备该聚合物过程中，以硫二甘醇作为模板分子，α-甲基丙烯酸作为功能单体，N,N-二甲基亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，过硫酸铵作为引发剂。其中，模板分子硫二甘醇通过氢键与功能单体α-甲基丙烯酸结合，加入交联剂和引发剂后，发生聚合反应，最后洗去模板分子，留下能特异性识别硫二甘醇的结合位点，制得硫二甘醇分子印迹聚合物。聚合物中这些结合位点能够对硫二甘醇进行记忆、识别和特异性吸附，因此该聚合物对于硫二甘醇具有良好的灵敏度和有益的选择性。当该分子印迹聚合物特异性吸附硫二甘醇后，由于硫二甘醇带有硫原子，能与金纳米颗粒形成牢固的金硫键，可以大量吸附金纳米颗粒，形成肉眼可见的红色，基于此，该分子印迹聚合物可以实现对硫二甘醇的可视化检测，将该分子印迹聚合物负载于硝酸纤维素膜上制成试纸，无需昂贵仪器，就能实现对芥子气中毒标志物硫二甘醇的现场即时检测，且在制备过程中通过优化模板分子与功能单体的摩尔比、洗脱剂和洗脱时间，以保证最终制备的试纸不但具有优异的硫二甘醇传感性能，还能提高其检测效率，后期使用过程中，通过优化其在含有硫二甘醇溶液中的浸泡时间、在金纳米颗粒溶液中的浸泡时间和温度，能够提高该试剂的检测效果。该硫二甘醇分子印迹聚合物及相应的试纸制备方法简单，易操作，适合扩大化生产。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为实施例1中中间产物的SEM图；
图2为实施例2中所使用的硝酸纤维素膜的SEM图；
图3为实施例2中超声处理1h后所得到的硝酸纤维素膜(即洗脱前的试纸)的SEM图；
图4为实施例2中制备的试纸依次浸泡于硫二甘醇的溶液和金纳米颗粒溶液后的SEM图；
图5为实施例2和对比实施例1中试纸洗脱前后结合金纳米颗粒后显色结果图(图5中A中a、b、c为实施例2中试纸洗脱前后结合金纳米颗粒后显色结果图，图5中A中d、e、f为对比实施例1中试纸洗脱前后结合金纳米颗粒后显色结果图，图5中B为IPP软件获取的各试纸的RGB值)；
图6为模板分子与功能单体的摩尔比值对试纸条显色程度的影响测试结果图；
图7为不同洗脱剂对试纸条显色程度的影响测试结果图；
图8为不同洗脱时间对试纸条显色程度的影响测试结果图；
图9为硫二甘醇的溶液中不同浸泡时间对试纸条显色程度的影响测试结果图；
图10为金纳米颗粒溶液中不同浸泡时间对试纸条显色程度的影响测试结果图；
图11为不同孵育时间对试纸条显色程度的影响测试结果图；
图12为以硫二甘醇浓度为横坐标，ΔRed值为纵坐标绘制线性回归曲线图；
图13为硫二甘醇检测选择性测试结果图；
图14为硫二甘醇检测抗干扰能力测试结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
制备硫二甘醇分子印迹聚合物
将α-甲基丙烯酸加入硫二甘醇溶液中，超声10min混匀后加入N,N-二甲基亚甲基双丙烯酰胺，超声处理30min混匀后加入过硫酸铵，35℃下超声处理1h后获得中间产物，将中间产物浸泡在氯仿中，超声处理10min后，置于摇床上摇匀50min，摇匀期间以新的氯仿置换前次氯仿，置换2次，取固相在30℃下干燥至恒重，制得硫二甘醇分子印迹聚合物，其中，α-甲基丙烯酸、硫二甘醇、N,N-二甲基亚甲基双丙烯酰胺和过硫酸铵的摩尔质量比为2:1:0.08:0.05，mol:mol:mg:mg。
实施例1中中间产物的SEM图如图1所示，由图1可知，该中间产物具有规则的球形结构，平均粒径为200-400nm。
实施例2
制备用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸
将α-甲基丙烯酸加入硫二甘醇溶液中，超声10min混匀后加入N,N-二甲基亚甲基双丙烯酰胺，超声处理30min混匀后加入过硫酸铵，并将5×10mm的硝酸纤维素膜浸泡于其中，35℃下超声处理1h后，取出硝酸纤维素膜并浸泡于氯仿中，超声处理10min后，置于摇床上摇匀50min，摇匀期间以新的氯仿置换前次氯仿，置换2次，取出硝酸纤维素膜在30℃下干燥至恒重，制得用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸，其中，α-甲基丙烯酸、硫二甘醇、N,N-二甲基亚甲基双丙烯酰胺和过硫酸铵的摩尔质量比为2:1:0.08:0.05，mol:mol:mg:mg。
实施例2中所使用的硝酸纤维素膜的SEM图如图2所示，由图2可知，硝酸纤维素膜具有良好的纤维和多孔结构。
实施例2中超声处理1h后所得到的硝酸纤维素膜(即洗前的试纸)的SEM图如图3所示，由图3可知，硫二甘醇分子印迹聚合物中间产物成功结合在硝酸纤维素膜表面。
将实施例2中制备的用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸浸泡于硫二甘醇浓度为1μg/mL的硫二甘醇的溶液中15min后，取出清洗至去除该试纸上的非模板分子，室温下放置5min后，于30℃下浸泡于金纳米颗粒溶液中50min，取出后以扫描电镜进行测试，结果如图4所示，由图4可知，该试纸上硫二甘醇分子印迹聚合物特异性结合了硫二甘醇，通过结合的硫二甘醇吸附大量的金纳米颗。
对比实施例1
与实施例2的区别在于，将α-甲基丙烯酸加入水溶液中，即未加入硫二甘醇，制得无硫二甘醇结合位点的试纸。
将实施例2中超声处理1h后所得到的硝酸纤维素膜(即洗脱前的试纸)于30℃下浸泡于金纳米颗粒溶液中50min，取出后显现红色(如图5中A中a所示)，这是由于此时试纸未经洗脱，其上还含有硫二甘醇，通过其上的硫二甘醇吸附大量的金纳米颗，从而显现红色。将实施例2中最终制备的试纸于30℃下浸泡于金纳米颗粒溶液中50min，取出后无明显红色(如图5中A中b所示)，是因为经洗洗脱后，试纸上硫二甘醇被大量洗出，无法吸附大量的金纳米颗，从而颜色变浅。将实施例2中最终制备的试纸浸泡于硫二甘醇浓度为1μg/mL的硫二甘醇的溶液中15min后，取出清洗至去除该试纸上的非模板分子，室温下放置5min后，于30℃下浸泡于金纳米颗粒溶液中50min，取出后显现红色(如图5中A中c所示)，是因为该试纸上硫二甘醇分子印迹聚合物特异性结合了硫二甘醇，通过结合的硫二甘醇吸附大量的金纳米颗。
将对比实施例1中超声处理1h后所得到的硝酸纤维素膜(即洗脱前的无硫二甘醇结合位点的试纸)于30℃下浸泡于金纳米颗粒溶液中50min，取出后无明显红色(如图5中A中d所示)，这是由于该试纸中无硫二甘醇，无法吸附大量的金纳米颗，从而无明显红色。将对比实施例1中最终制备的试纸于30℃下浸泡于金纳米颗粒溶液中50min，取出后无明显红色(如图5中A中e所示)，同样也是因为该试纸中无硫二甘醇，无法吸附大量的金纳米颗，从而无明显红色。将对比实施例1中最终制备的试纸浸泡于硫二甘醇浓度为1μg/mL的硫二甘醇的溶液中15min后，取出清洗至去除该试纸上的非模板分子，室温下放置5min后，于30℃下浸泡于金纳米颗粒溶液中50min，取出后无明显红色(如图5中A中f所示)，是因为该试纸上无硫二甘醇结合位点，无法结合硫二甘醇，故不能通过结合的硫二甘醇吸附大量的金纳米颗。
进一步用IPP软件获取了各试纸的RGB值，可以看出其上红色值的变化趋势(如图5中B所示)与图5中A肉眼观察到的颜色响应完全一致，以上结果证明实施例2中负载有硫二甘醇分子印迹聚合物的试纸可以实现对硫二甘醇的特异性识别。
实施例3
在实施例2的基础上，将硫二甘醇和α-甲基丙烯酸的摩尔比依次设定为1:0、1:2、1:4、1:6和1:8，考察模板分子与功能单体的摩尔比值对试纸条显色程度的影响，结果如图6所示，由图6可知，当硫二甘醇和α-甲基丙烯酸的摩尔比为1:2时，试纸的红色值最强，这是因为一分子硫二甘醇可以与两分子的α-甲基丙烯酸形成氢键，因此当二者摩尔比为1:2时，能制备特异性识别硫二甘醇的硫二甘醇分子印迹聚合物，从而使最终制备的试纸具有最佳的硫二甘醇传感性能。
实施例4
在实施例2的基础上，依次以二氯甲烷、氯仿、水和乙醇水溶液作为洗脱剂，考察不同洗脱剂对试纸条显色程度的影响，结果如图7所示，由图7可知，在洗脱硫二甘醇前后，氯仿不仅可以将硫二甘醇洗脱干净，而且重新吸附硫二甘醇的能力也是最优的。
实施例5
在实施例2的基础上，将放置在摇床上摇匀的时间依次设定为10min、20min、30min、40min、50min和60min，考察不同洗脱时间对试纸条显色程度的影响，结果如图8所示，由图8可知，洗脱时间为50min时可获得最佳洗脱效果。如果洗脱时间太短，则硫二甘醇的去除将不彻底，相反，当洗脱时间过长时，硝酸纤维素膜上的中间产物将会丢失太多，导致后期红色信号值恢复较差。
实施例6
分别将实施例2中制备的用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸浸泡于硫二甘醇浓度为1μg/mL的硫二甘醇的溶液中5min、10min、15min、20min、25min、30min后，取出清洗至去除上述试纸上的非模板分子，室温下放置5min后，于30℃下浸泡于金纳米颗粒溶液中50min，同时以将实施例2中制备的用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸直接于30℃下浸泡于金纳米颗粒溶液中50min作为对照，计算上述各试纸与对照试纸红色值的差值(ΔRed值)，结果如图9所示，由图9可知，浸泡时间为15min的试纸与对照试纸的ΔRed值最大，说明试纸中硫二甘醇分子印迹聚合物与溶液中硫二甘醇最佳的结合时间为15min。
实施例7
将实施例2中制备的用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸浸泡于硫二甘醇浓度为1μg/mL的硫二甘醇的溶液中15min后，取出清洗至去除上述试纸上的非模板分子，室温下放置5min后，于30℃下分别浸泡于金纳米颗粒溶液中10min、20min、30min、40min、50min、60min和70min，同时以将实施例2中制备的用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸直接于30℃下分别浸泡于金纳米颗粒溶液中10min、20min、30min、40min、50min、60min和70min作为相应对照，计算上述各试纸与相应照试纸红色值的差值(ΔRed值)，结果如图10所示，由图10可知，浸泡时间为50min的试纸与对照试纸的ΔRed值最大，说明试纸中硫二甘醇与金纳米颗最佳作用时间为50min。
实施例8
将实施例2中制备的用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸浸泡于硫二甘醇浓度为1μg/mL的硫二甘醇的溶液中15min后，取出清洗至去除上述试纸上的非模板分子，室温下放置5min后，分别于25℃、30℃、35℃和40℃下浸泡于金纳米颗粒溶液中50min，同时以将实施例2中制备的用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸直接分别于25℃、30℃、35℃和40℃下浸泡于金纳米颗粒溶液中50min，记录上述各试纸和相应试纸的红色值，绘制成图，如图11所示，由图11可知，各温度下，试纸吸附了硫二甘醇后再结合金纳米颗粒所显示的红色值均大于未吸附硫二甘醇后再结合金纳米颗粒所显示的红色值，其中，30℃时试纸条红色值的变化最大，因此30℃为最佳孵育时间。
实施例9
将实施例2中制备的用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸分别浸泡于硫二甘醇浓度为1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10μg/mL、100μg/mL的硫二甘醇的溶液中15min后，取出清洗至去除上述试纸上的非模板分子，室温下放置5min后，均于30℃下浸泡于金纳米颗粒溶液中50min，同时以将实施例2中制备的用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸直接于30℃下浸泡于金纳米颗粒溶液中50min作为对照，计算上述各试纸与对照试纸红色值的差值(ΔRed值)，以硫二甘醇浓度为横坐标，ΔRed值为纵坐标绘制线性回归曲线，如图12所示，试纸的ΔRed值与硫二甘醇浓度呈线性关系，获得线性回归方程Log(ΔR％)＝0.215c-0.094，r2＝0.98237，检测限(LOD，S/N＝3)为5.04ng/mL，该值远低于文献报道的传统检测方法的检测限。
实施例10
硫二甘醇检测选择性测试
将实施例2中制备的用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸分别浸泡于硫二甘醇浓度为0ng/mL、101ng/mL、102ng/mL、103ng/mL、104ng/mL、105ng/mL、106ng/mL的硫二甘醇的溶液中15min后，取出清洗至去除上述试纸上的非模板分子，室温下放置5min后，均于30℃下浸泡于金纳米颗粒溶液中50min。参照上述方法，将其中硫二甘醇的溶液依次替换为谷氨酰胺溶液、半胱氨酸溶液、蛋氨酸溶液、苯丙氨酸溶液和γ-氨基丁酸溶液，观察经不同浓度不同溶液处理后的试纸的颜色变化，结果如图13所示，由图13可知，本发明中试纸对硫二甘醇的响应最强，而对谷氨酰胺、半胱氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和γ-氨基丁酸的响应非常弱。值得注意的是，半胱氨酸和蛋氨酸在结构上和硫二甘醇非常接近，并都含有硫元素，但即使加入高浓度(106ng/mL)的半胱氨酸和蛋氨酸，本发明中试纸都不会显示出明显的红色，表明该试纸对硫二甘醇的检测具有很好的选择性，这主要归功于试纸上硫二甘醇分子印迹聚合物对硫二甘醇的特异性识别能力。
实施例11
硫二甘醇检测抗干扰能力测试
将实施例2中制备的用于检测芥子气中毒标志物硫二甘醇的试纸浸泡于硫二甘醇浓度为1μg/mL的硫二甘醇的溶液中15min后，取出清洗至去除该试纸上的非模板分子，室温下放置5min后，于30℃下浸泡于金纳米颗粒溶液中50min，取出后于室温下分别浸泡在硫二甘醇浓度为1μg/mL的硫二甘醇的溶液中，分别含有Na+、K+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Fe2+、Mn2+、Ba2+和Al3+的硫二甘醇的溶液中，分别含有尿酸、尿素、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和葡萄糖的硫二甘醇的溶液中孵育30min，其中，Na+、K+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Fe2+、Mn2+、Ba2+、Al3+和尿酸、尿素、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和葡萄糖的浓度为10μg/mL，硫二甘醇的溶液中硫二甘醇浓度为1μg/mL。均未观察到明显的颜色变化，如图14所示，说明本发明中试纸具有优异的抗干扰能力。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
