一种乳酸菌胞外多糖及其衍生物的制备方法
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种乳酸菌胞外多糖及其衍生物的制备方法。
背景技术
乳酸菌是食品工业中安全性相对较高的一类生产菌种，它的益生功能一方面是益生菌自身的代谢作用来实现的，另一方面则是胞外多糖在起作用，其产生的胞外多糖(EPS)是在乳酸菌生长代谢过程中分泌到细胞外的一种次级代谢产物。它对机体无毒副作用，具有很低的细胞毒性，是一种潜在的优良抗氧化物质，它也具有免疫活性，能够抑制癌细胞增殖和转移，这与乳酸菌的种类和结构有关。它可以作为粘附因子帮助乳酸菌在肠道中粘附定植，从而竞争性地抑制有害菌的增殖，减少有害物质的产生，它具有抗肿瘤活性，这与乳酸菌的粘附作用、抗氧化性和免疫调节作用紧密相关。
乳酸菌胞外多糖所具有的活性直接或间接地与其分子结构有关，采取一定的方法对胞外多糖分子的结构进行修饰，得到的衍生物可以提高其生物活性，甚至增加新的功能，并且也受到了越来越多的关注。多糖的磷酸化反应，主要是一种共价修饰，是支链上的羟基被磷酸根取代的过程。在多糖的衍生物中，硫酸类衍生物也是比较重要的一种，多糖的糖羟基被硫酸根取代后，不仅可以提高多糖的水溶性，也会使糖链在局部区域形成螺旋结构，从而提高多糖的生物活性。
鼠李糖乳杆菌是人体肠道内一类重要的益生菌，具有调节肠道菌群、高效降低胆固醇、预防和治疗腹泻、提高机体免疫力等作用。虽然乳酸菌胞外多糖应用前景广阔，但还存在产量较低和纯度不高等问题，使应用受到了一定的限制，也是制约工业化大规模生产的主要影响因素。因此，提高胞外多糖的产量和活性成为目前研究的热点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种提高乳酸菌胞外多糖产量的乳酸菌胞外多糖及其衍生物的制备方法。
本发明采用的技术方案是：一种乳酸菌胞外多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)粗乳酸菌胞外多糖的制备：将活化的乳杆菌菌种按3％的接种量接种至改进的MRS选择性培养基上，培养24h后离心去除沉淀菌体，取上清液；将上清液依次进行除蛋白，减压浓缩，醇沉，离心取沉淀，超纯水溶解，冷冻干燥，得粗乳酸菌胞外多糖；
(2)纯乳酸菌胞外多糖的制备：将粗乳酸菌胞外多糖溶于超纯水中，沿柱壁缓慢加入到DEAE-52纤维素柱中，依次用超纯水和NaCl溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液，减压浓缩，透析24h，冷冻干燥，得纯乳酸菌胞外多糖。
进一步的，上述的制备方法，所述改进的MRS选择性培养基组成为：按重量百分比含有1％低聚半乳糖、2％大豆蛋白胨、0.2％磷酸盐和水余量；碳氮比为1：2，初始pH值为6.5。
进一步的，上述的制备方法，步骤(1)中，所述除蛋白是，于上清液中加入聚酰胺，添加量为120g/L，磁力搅拌8h。
进一步的，上述的制备方法，步骤(1)中，所述醇沉是，于减压浓缩后的浓缩物中加入4倍体积的95％乙醇，醇沉时间为12h。
进一步的，上述的制备方法，步骤(2)中，所述用超纯水和NaCl溶液进行梯度洗脱，收集梯度洗脱液的方法是：依次用超纯水和0.1、0.2、0.3、0.4mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，每15mL为一管，收集梯度洗脱液；用苯酚-硫酸法跟踪检测每管洗脱液中多糖的浓度，取多糖浓度最高的几管洗脱液，将洗脱液合并。
一种乳酸菌胞外多糖衍生物的制备方法，所述乳酸菌胞外多糖衍生物为磷酸化乳酸菌胞外多糖衍生物，制备方法包括如下步骤：取纯乳酸菌胞外多糖和六偏磷酸钠，混合均匀，调节混合液的pH为6.0，于90℃下反应4h，冷却至室温，醇沉，将所得沉淀旋转蒸发后，在50℃水浴中复溶，透析，真空冷冻干燥，得磷酸化乳酸菌胞外多糖衍生物。
进一步的，上述的制备方法，按质量比，m纯乳酸菌胞外多糖：m六偏磷酸钠＝6:1。
进一步的，上述的制备方法，所述醇沉是，于冷却至室温的产物中，加入三倍体积的95％乙醇，进行醇沉24h。
一种乳酸菌胞外多糖衍生物的制备方法，所述乳酸菌胞外多糖衍生物为硫酸化乳酸菌胞外多糖衍生物，制备方法包括如下步骤：将纯乳酸菌胞外多糖悬浮于二甲基甲酰胺中，搅拌20min后逐滴加入到酯化试剂中，于60℃下反应2h，冷却至室温，用4mol/L的NaOH中和至pH值为7后，用95％的乙醇在4℃下沉淀12h，离心后取沉淀，先用95％乙醇洗涤，再用去离子水复溶，用流水袋透析24h，冻干，得硫酸化乳酸菌胞外多糖衍生物。
进一步的，上述的制备方法，所述酯化试剂是氯磺酸(CSA)-吡啶(Pyr)，制备方法包括如下步骤：在冰水浴中，将氯磺酸缓缓加入到吡啶中，缓慢搅拌，充分反应，当观察到出现大量浅黄色固体时，撤去冰水浴，得到氯磺酸(CSA)-吡啶(Pyr)，反应在30min内完成。
本发明的有益效果是：通过本发明的方法，提高了乳酸菌胞外多糖的纯度和产量。并对乳酸菌胞外多糖进行了磷酸和硫酸化修饰，得到了乳酸菌胞外多糖的磷酸化和硫酸化衍生物，提高了乳酸菌胞外多糖及其衍生物的生物活性，在功能性保健食品领域中具有一定的应用价值。
附图说明
图1是苯酚-硫酸法测定葡萄糖的标准曲线。
图2是实施例4中乳酸菌胞外多糖及衍生物清除羟自由基能力曲线。
图3是实施例4中乳酸菌胞外多糖及衍生物DPPH自由基清除活性曲线。
具体实施方式
实施例1一种乳酸菌胞外多糖
(一)制备方法，包括如下步骤：
本实施例，乳杆菌采用鼠李糖乳杆菌。
1、粗乳酸菌胞外多糖的制备：
改进的MRS选择性培养基的制备：按重量百分比含有1％低聚半乳糖、2％大豆蛋白胨、0.2％磷酸盐和水余量；碳氮比为1：2，初始pH值为6.5。
将鼠李糖乳杆菌进行活化：在无菌条件下取少量鼠李糖乳杆菌冻干菌粉，与MRS液体培养基充分混合并完全溶解，将其放入37℃的摇床中培养24h，观察到培养基变浑浊，连续两次继代培养后菌种恢复其活性。
将活化的鼠李糖乳杆菌，按3％的接种量接种至改进的MRS选择性培养基上，在37℃摇床中振荡培养24h后，10000r/min离心10min去除沉淀菌体，取上清液。
于上清液中加入聚酰胺，添加量为120g/L，室温下磁力搅拌8h，抽滤，得除去蛋白的上清液。
将所得除去蛋白的上清液减压浓缩至原体积的约20％后，加入浓缩物4倍体积的95％乙醇，4℃下放置醇沉12h，10000r/min离心10min取沉淀，用少量超纯水溶解后，冷冻干燥，得粗乳酸菌胞外多糖。
2、纯乳酸菌胞外多糖的制备：
DEAE-52纤维素柱的制备：向层析柱中加入约1/3的超纯水，然后将DEAE-52纤维素沿柱壁缓慢倒入层析柱，添加到柱长的2/3处，待柱内纤维素均匀分布达到平衡后，得DEAE-52纤维素柱。
称取步骤1所得粗乳酸菌胞外多糖0.5g溶于50mL超纯水中后，沿柱壁缓慢加入到DEAE-52纤维素柱中，先用150mL超纯水洗脱，再分别用300mL的0.1、0.2、0.3、0.4mol/LNaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，每15mL收集一管梯度洗脱液。用苯酚-硫酸法跟踪检测每管洗脱液中多糖的浓度，取多糖浓度最高的几管洗脱液(本实例收集的是第23管和第55管)，将该两管洗脱液合并后，减压浓缩，浓缩物用截留分子量为3500的透析袋透析24h，冷冻干燥，得纯乳酸菌胞外多糖。
(二)检测
1、多糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法测定
1)标准曲线的制作
取16支具塞试管，编号管0以及管1-5每组三组平行，按表1取浓度为100mg/L的葡萄糖标准溶液加蒸馏水定容至1mL，得系列葡萄糖浓度溶液，于系列葡萄糖浓度溶液中按表1加入试剂苯酚和硫酸，盖塞后，将各试管中的溶液振荡摇匀，将试管放置于30℃水浴中反应20min，以管0为空白对照，在490nm处测吸光值。以葡萄糖浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，取三组平均值，绘出标准曲线，结果如图1。
表1
标准曲线如图1，由图1可见，在0-100μg/mL的浓度范围内具有线性关系，线性方程为y＝0.008x-0.0064，R2＝0.9959。
2)样品中多糖含量的测定
将制备的纯乳酸菌胞外多糖用超纯水溶解，制备浓度为50μg/mL的样品溶液。取1.0mL样品溶液，向溶液中加入1.0mL浓度为5％的苯酚溶液，再快速加入5.0mL浓硫酸，充分振荡混匀，将试管放置于30℃水浴中反应20min，在490nm处测吸光值。将OD490nm带入标准曲线计算溶液中的糖浓度，再乘以0.9(校正系数)和稀释倍数即得其多糖含量，结果如表2。
表2
由表2可见，采用本申请的方法，纯乳酸菌胞外多糖纯度可达67.3％，产量为3.089g/L。
实施例2磷酸化乳酸菌胞外多糖衍生物
(一)制备方法包括如下步骤：
按质量比，m纯乳酸菌胞外多糖：m六偏磷酸钠＝6:1，称取实施例1制备的纯乳酸菌胞外多糖和六偏磷酸钠，混合均匀，调节混合液的pH为6.0，于90℃下反应4h，冷却至室温，加入三倍体积的乙醇后，于4℃下放置醇沉24h，10000r/min离心10min取沉淀，旋转蒸发后，在50℃水浴中复溶，然后放入透析袋中透析，并测定透析前后电导率的变化。当电导率从最初的>1×104μs/cm减少到160μs/cm左右时，停止透析，真空冷冻干燥，得磷酸化乳酸菌胞外多糖衍生物。
(二)检测
1、磷酸根基团取代度的测定：采用磷钼酸胺法测定
1)Tris缓冲溶液的配制：称量1.2g Tris试剂，40mg MgCl2·6H2O，加入适量蒸馏水充分溶解后，转移到100mL容量瓶中，定容，用0.1mol/L的稀盐酸将溶液pH值调至中性，即为Tris缓冲溶液。
2)定磷试剂的配制：取5mL质量分数为20％的Vc溶液，5mL浓度为3mol/L的H2SO4，5mL质量分数为3％的钼酸铵溶液，混合均匀，即为定磷试剂。
3)磷酸根基团标准溶液的配制：称取716.5mg磷酸二氢钾，用适量蒸馏水溶解后，转移至1000mL的容量瓶中，用蒸馏水定容，即为质量浓度为0.01mg/mL的磷酸根基团标准溶液母液。
将浓度为0.01mg/mL的磷酸根基团标准溶液母液依次进行稀释，分别获得浓度为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01mg/mL的磷酸根基团标准溶液。
4)标准曲线的制作
在具塞试管中分别加入浓度为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01mg/mL的磷酸根基团标准溶液5mL，再向试管中依次加入Tris缓冲溶液3mL，摇匀之后迅速加入3mL定磷试剂，再次混匀后放置恒温45℃的水浴锅中，反应30min，冷却至室温后，在580nm处测定吸光值，以磷酸根基团标准浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，做标准曲线。磷酸根基团浓度曲线线性关系良好，得到线性回归方程为：y＝0.1279x+0.0202，R2＝0.9975。
5)样品中磷酸根基团的测定
称取0.01g磷酸化乳酸菌胞外多糖衍生物于烧杯中，加入2mL硫酸和硝酸(体积比为1:1)的混合液，反应2h后，将所得产物转移到具塞试管中，用蒸馏水定容至5mL，再向试管中依次加入Tris缓冲溶液3mL，摇匀之后迅速加入3mL定磷试剂，再次混匀后放置恒温45℃的水浴锅中，反应30min，冷却至室温后，在580nm处测量吸光度，根据线性回归方程计算磷酸根基团的浓度(P)，然后根据公式(1)计算磷酸根基团取代度：
DSP：磷酸根基团的取代度
P：磷酸根基团浓度。
经检测，磷酸化乳酸菌胞外多糖衍生物中，磷酸根基团取代度为0.86。
实施例3硫酸化乳酸菌胞外多糖衍生物
(一)制备方法，包括如下步骤：
酯化试剂的制备：在冰水浴中，将4mL氯磺酸缓缓加入到10mL吡啶中，缓慢搅拌，确保二者充分反应，当观察到出现大量浅黄色固体时，撤去冰水浴，得到氯磺酸(CSA)-吡啶(Pyr)酯化试剂，反应在30min内完成。
取实施例1制备的纯乳酸菌胞外多糖0.5g悬浮于30mL二甲基甲酰胺中，搅拌20min后逐滴加入到4mL酯化试剂中，于60℃下反应2h，冷却至室温，用4mol/L的NaOH中和至pH值为7后，加入三倍体积的95％的乙醇在4℃下沉淀12h，离心后取沉淀，先用95％乙醇洗涤，再用去离子水复溶，用流水袋透析24h，冻干，得硫酸化乳酸菌胞外多糖衍生物。
(二)检测
1、硫酸根基团取代度的测定：采用BaSO4浊度法
1)硫酸根基团标准溶液的配制：称取0.0888g无水Na2SO4固体，加入适量0.1mol/L稀盐酸溶解，转移至100mL容量瓶中，定容，即为0.6mg/mL硫酸根基团标准溶液。
2)氯化钡-明胶溶液的配制：
称取1g明胶于烧杯中，加入适量水溶解，转移至200mL容量瓶中，加水定容，得明胶溶液。
称取0.5864g BaCl2·2H2O，溶解于新制的100mL明胶溶液中，混合均匀，得氯化钡-明胶溶液。
3)标准曲线的制作：取16支具塞试管，按表3加入试剂，待反应10min后，用紫外分光光度计在360nm处测吸光值记为A1，再用相同体积的明胶溶液代替BaCl2-明胶溶液，重复上述操作，在360nm处测吸光值记为A2。以A1-A2的差值作为纵坐标，硫酸根基团的浓度作为横坐标，绘制标曲。
表3
硫酸基团浓度曲线线性关系良好，得到线性回归方程为：y＝0.9869x+0.0015，R2＝0.9983。
4)样品中硫酸根的测定
将制备的硫酸化乳酸菌胞外多糖衍生物0.01g溶于10ml 1mol/L的稀盐酸溶液中，沸水浴中密封水解反应3h。取两份0.4mL的水解液，按上述操作在360nm处测得样品的A1值(BaCl2-明胶溶液)和A2值(明胶溶液)，根据线性回归方程计算硫酸基团浓度(S)，然后根据公式(2)计算硫酸根基团的取代度。
DSS：硫酸根基团的取代度
S％：样品中硫酸基团浓度(S)。
经检测，硫酸化乳酸菌胞外多糖衍生物中，硫酸根基团取代度为0.95。
实施例4乳酸菌胞外多糖及衍生物抗氧化活性测定
(一)清除羟自由基能力
1、方法：将浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mg/mL的乳酸菌胞外多糖(EPS)、磷酸化乳酸菌胞外多糖衍生物(P-EPS)和硫酸化乳酸菌胞外多糖衍生物(S-EPS)样品，各吸取1mL装入带塞试管中。在每个试管中依次加入1mL的9mmol/L FeSO4溶液和乙醇-水杨酸溶液(将0.124g水杨酸溶解于10mL无水乙醇中)。充分混匀后加入1mL的9mmol/L H2O2溶液。再次混匀后，置于37℃水浴中恒温反应30min。待冷却至室温后，在510nm处用紫外分光光度计测量吸光值，以抗坏血酸为阳性参照。重复三次，取平均值。
A0：空白对照溶液的吸光度
AS：加入样品后的吸光值
2、结果
结果如图2所示，EPS清除OH自由基的能力随浓度的增加而提高，浓度为2.5mg/mL时，OH自由基清除率达到79.12％，经过硫酸化和磷酸化修饰后的胞外多糖对羟自由基也呈现出较好的清除作用，且P-EPS的清除效果明显好于S-EPS和EPS，当多糖浓度为2.5mg/mL时，S-EPS和P-EPS的清除率分别为88.26％和91.03％。
(二)DPPH自由基清除活性
配制浓度为0.5，1.0，2.0，4.0，6.0mg/mL的乳酸菌胞外多糖(EPS)、磷酸化乳酸菌胞外多糖衍生物(P-EPS)硫酸化乳酸菌胞外多糖衍生物(S-EPS)样品，各取2mL至15mL离心管，加入0.1mmol/L DPPH-乙醇溶液(将0.0099g DPPH溶解于250mL乙醇中)2mL，振荡均匀，于暗处静置30min，在4℃下10000r/min离心10min，取上清液，在517nm用无水乙醇调零，测定吸光度。以抗坏血酸为阳性对照，重复三次。
Ai：样品的OD517nm
A0：以无水乙醇代替DPPH的OD517nm
A1：以超纯水代替样品溶液的OD517nm2、结果
结果如图3所示，乳酸菌胞外多糖和经硫酸化及磷酸化修饰后的乳酸菌胞外多糖均有一定的抗氧化活性，且修饰后抗氧化能力有所增加，当多糖浓度为6mg/mL时，EPS对DPPH·的清除率为26.09％，S-EPS和P-EPS对DPPH·清除率分别为36.97％和59.48％，说明经磷酸化和硫酸化修饰后的乳酸菌胞外多糖对DPPH·的清除作用优于乳酸菌胞外多糖对DPPH·的清除作用。
