一种葡萄糖基甜菊糖苷的制备方法
技术领域
本发明属于生物合成和新型甜味剂领域，特别涉及一种葡萄糖基甜菊糖苷的制备方法。
背景技术：
人们意识到许多疾病与食用高糖食品和饮料相关，蔗糖的替代品正在受到日益剧增的关注。然而，由于安全性的问题，许多人造甜味剂，如甜精、环己基氨基磺酸钠和糖精在一些国家被禁止或限制。因此，天然来源的无热量甜味剂正变得越来越流行。甜叶菊叶子中产生多种双萜糖苷，拥有高强度的甜味和不易被人体吸收的特性，因此由甜叶菊干叶中提取的天然甜味剂甜菊糖苷能够成为优良的替代蔗糖产品。
天然甜味剂甜菊糖苷是一类具有共同的糖苷配基（甜菊醇）的提取物，并且区别在于C13和C19位置的碳水化合物残基的数量和类型，甜菊叶子中发现的主要糖苷是莱鲍迪苷A(2-10％%20)、甜菊苷(2-10％%20)和莱鲍迪苷C(1-2％%20)。其他糖苷，如莱鲍迪苷B、D、E和F，甜菊双糖苷和甜茶苷，以低得多的水平被发现(大约0-1％%20)。
天然甜味剂甜菊糖苷主要成分中莱鲍迪苷A具有最少的涩味、最少的苦味和最不持久的余味，因此其具有最受欢迎的感官属性，然而，即使在高度纯化的状态下，莱鲍迪苷A仍然具有不合需要的味道属性，如苦味、甜的余味、甘草味等。甜菊甜味剂中这些不合需要的味道属性成为商业化的主要障碍之一，影响了甜菊糖的味质，限制了其更为广泛的应用。
葡萄糖基甜菊糖苷，是一种利用上述天然甜菊糖为原料，经酶催化等方法使甜菊糖中的甜菊苷、莱鲍迪苷A等成分与葡萄糖基进行聚合反应而成，其甜度倍数较高是蔗糖甜度的100-250倍，且大幅改善了天然甜菊糖苷的苦味、甜的余味、甘草味等不良口感，使其具有优良的味质，使其具有了更为广泛的应用。
目前主要的方法是利用生物酶法进行生产葡萄糖基甜菊糖苷，但由于植物提取的甜菊糖原料成分纯度低，糖基供体种类及结构等影响造成酶改质甜菊糖普遍具有转化率较低，糖基供体残留多，口感及色泽不佳，操作步骤繁杂，浪费资源等缺点。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有生物酶法生产葡萄糖基甜菊糖苷过程中存在的转化率较低，糖基供体残留多，口感及色泽不佳，操作步骤繁杂，浪费资源等缺陷，提供一种葡萄糖基甜菊糖苷的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种葡萄糖基甜菊糖苷的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将甜菊提取物：环糊精按质量比1：1-2进行混合，随后加水配置成质量浓度为10%-60%的混合溶液，随后放置于40-80℃下，搅拌条件下预热1-3h生成悬浊液；
（2）向悬浊液中加入环糊精糖基转移酶(%20CGT酶%20)，控制环糊精糖基转移酶的质量为环糊精质量的2-10%，随后置于40-80℃下、在100-300rpm/min转速下搅拌反应1-96h，继续升温至105℃以上并持续30-60min，通过持续高温使环糊精糖基转移酶(%20CGT酶%20)失活变性以停止反应；
（3）反应结束后，将反应液用脱色树脂（维华%20SHD-806）进行脱色处理，收集脱色后溶液，脱色后溶液继续用阴阳离子交换树脂（东大001×8大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂；东大201×7大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂）进行脱盐处理，收集脱盐后溶液，脱盐后溶液使用大孔吸附树脂去除非二萜化合物（例如：多个按序连接的填充大孔吸附树脂的柱），吸附操作后使用蒸馏水或去离子水洗涤柱，然后用20-70％体积分数的乙醇进行解吸操作，并收集含二萜化合物（甜菊糖）的乙醇解吸液；
（4）对含二萜化合物（甜菊糖）的乙醇解吸液进行蒸发浓缩，控制浓缩液中甜菊糖质量浓度在60%以上，继续对浓缩液进行喷雾干燥，控制进口温度（110-150℃），收集干燥后呈粉末状的产品，经过包装即制备完成的葡萄糖基糖苷产品。
进一步，步骤（1）所述甜菊提取物中总苷含量≥90wt％，其中甜菊苷占40-60wt％、莱鲍迪苷A占30-50wt％。
进一步，步骤（1）所述环糊精为α环糊精、β环糊精、γ环糊精中的一种或其任意混合。
进一步，步骤（2）所述反应温度优选为55-65℃，反应时间优选为24-50h，搅拌速度优选为180-240rpm/min。
进一步，步骤（3）所述大孔吸附树脂为具有较高选择性只吸附二萜化合物（甜菊糖）的树脂产品或已经商品化的能够具有较高选择性只吸附二萜化合物（甜菊糖）的树脂产品。
本发明的有益效果：
1.本发明对所述甜菊糖原料具有较高转化率，可通过一次反应将中的甜菊苷与莱鲍迪苷A等成分转化率达到90%以上；
2.本发明反应后体系中糖基供体残留较少，残留量在质量分数20%以下；
3.本发明反应温度较低，搅拌速率低，工艺简单能耗较低，所用溶剂（乙醇等）可实现浓缩回收循环利用，实现了较低的环境污染与较高的经济效益，为生产一种优质的葡萄糖基甜菊糖苷提供了一种可靠的方法。
具体实施方式
一种葡萄糖基甜菊糖苷的制备方法，具体实施步骤如下：
实施例1
（1）准确称取100g商业化甜菊提取物为原料（制备检测样品一），150g商业化的食品级β环糊精为糖基供体，加入250g纯水进行搅拌溶解，随后放置于70℃水浴条件下，%20200rpm/min下预热1h生成悬浊液；
（2）向悬浊液中加入加入7g环糊精葡萄糖苷转移酶（Novozymes生产），随后置于70℃下并以搅拌速度为200rpm/min条件下持续反应48h，继续升温至105℃并持续60min，通过持续高温使环糊精糖基转移酶(%20CGT酶%20)失活变性以停止反应；
（3）反应结束后，将反应液自然冷却至室温，用脱色树脂（维华%20SHD-806）进行脱色处理，收集脱色后溶液，脱色后溶液继续用阴阳离子交换树脂（东大001×8大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂；东大201×7大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂）进行脱盐处理，收集脱盐后溶液，脱盐后溶液再用大孔吸附树脂（苏青%20DA201-H）去除非二萜化合物，依次用蒸馏水洗涤分离柱、体积分数的50％乙醇解吸分离柱，并收集含甜菊糖的乙醇解吸液；
（4）对含甜菊糖的乙醇解吸液（12%20L）进行蒸发浓缩，将乙醇解吸液浓缩至400ml，用喷雾干燥机对浓缩液进行喷雾干燥（进口温度125℃），收集干燥后呈粉末状的产品220g（制备检测样品二），经过包装即制备完成的葡萄糖基糖苷产品。
样品一和样品二液相检测结果如下：
采用实施例1方法，甜菊糖原料RA转化率为92.18%；甜菊苷转化率为94.9%。
实施例2
（1）准确称取100g商业化甜菊提取物为原料（制备检测样品一），120g商业化的食品级α环糊精为糖基供体，加入250g纯水进行搅拌溶解，随后放置于60℃水浴条件下， 150rpm/min下预热1h生成悬浊液；
（2）向悬浊液中加入加入5g环糊精葡萄糖苷转移酶（Novozymes生产），随后置于60℃下并以搅拌速度为150rpm/min条件下持续反应28h，继续升温至110℃并持续60min，通过持续高温使环糊精糖基转移酶( CGT酶 )失活变性以停止反应；
（3）反应结束后，将反应液自然冷却至室温，用脱色树脂（维华 SHD-806）进行脱色处理，收集脱色后溶液，脱色后溶液继续用阴阳离子交换树脂（东大001×8大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂；东大201×7大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂）进行脱盐处理，收集脱盐后溶液，脱盐后溶液再用大孔吸附树脂（苏青 DA201-H）去除非二萜化合物，依次用蒸馏水洗涤分离柱、体积分数的50％乙醇解吸分离柱，并收集含甜菊糖的乙醇解吸液；
（4）对含甜菊糖的乙醇解吸液（11 L）进行蒸发浓缩，将乙醇解吸液浓缩至350ml，用喷雾干燥机对浓缩液进行喷雾干燥（进口温度120℃），收集干燥后呈粉末状的产品200g（制备检测样品二），经过包装即制备完成的葡萄糖基糖苷产品。
样品一和样品二液相检测结果如下：
采用实施例2方法，甜菊糖原料RA转化率为91.14%；甜菊苷转化率为95%。
实施例3
（1）准确称取100g商业化甜菊提取物为原料（制备检测样品一），75g商业化的食品级α环糊精和75g商业化的食品级β环糊精为糖基供体，加入250g纯水进行搅拌溶解，随后放置于70℃水浴条件下， 200rpm/min下预热1h生成悬浊液；
（2）向悬浊液中加入加入6g环糊精葡萄糖苷转移酶（Novozymes生产），随后置于70℃下并以搅拌速度为150rpm/min条件下持续反应48h，继续升温至110℃并持续60min，通过持续高温使环糊精糖基转移酶( CGT酶 )失活变性以停止反应；
（3）反应结束后，将反应液自然冷却至室温，用脱色树脂（维华 SHD-806）进行脱色处理，收集脱色后溶液，脱色后溶液继续用阴阳离子交换树脂（东大001×8大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂；东大201×7大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂）进行脱盐处理，收集脱盐后溶液，脱盐后溶液再用大孔吸附树脂（苏青 DA201-H）去除非二萜化合物，依次用蒸馏水洗涤分离柱、体积分数的50％乙醇解吸分离柱，收集含甜菊糖的乙醇解吸液；
（4）对含甜菊糖的乙醇解吸液（9.2 L）进行蒸发浓缩，将乙醇解吸液浓缩至400ml，用喷雾干燥机对浓缩液进行喷雾干燥（进口温度120℃），收集干燥后呈粉末状的产品230g（制备检测样品二），经过包装即制备完成的葡萄糖基糖苷产品。
样品一和样品二液相检测结果如下：
采用实施例3方法，甜菊糖原料RA转化率为93.25%；甜菊苷转化率为93.83%。
实施例4
（1）准确称取100g商业化甜菊提取物为原料（制备检测样品一），50g商业化的食品级α环糊精和50g商业化的食品级β环糊精和50g商业化的食品级γ环糊精为糖基供体，加入250g纯水进行搅拌溶解，随后放置于65℃水浴条件下，150rpm/min下预热1h生成悬浊液；
（2）向悬浊液中加入加入7g环糊精葡萄糖苷转移酶（Novozymes生产），随后置于65℃下并以搅拌速度为150rpm/min条件下持续反应48h，继续升温至110℃并持续60min，通过持续高温使环糊精糖基转移酶( CGT酶 )失活变性以停止反应；
（3）反应结束后，将反应液自然冷却至室温，用脱色树脂（维华 SHD-806）进行脱色处理，收集脱色后溶液，脱色后溶液继续用阴阳离子交换树脂（东大001×8大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂；东大201×7大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂）进行脱盐处理，收集脱盐后溶液，脱盐后溶液再用大孔吸附树脂（苏青 DA201-H）去除非二萜化合物，依次用蒸馏水洗涤分离柱、体积分数的50％乙醇解吸分离柱，并收集含甜菊糖的乙醇解吸液；
（4）对含甜菊糖的乙醇解吸液（12 L）进行蒸发浓缩，将乙醇解吸液浓缩至400ml，用喷雾干燥机对浓缩液进行喷雾干燥（进口温度120℃），收集干燥后呈粉末状的产品225g（制备检测样品二），经过包装即制备完成的葡萄糖基糖苷产品。
样品一和样品二液相检测结果如下：
采用实施例4方法，甜菊糖原料RA转化率为93.14%；甜菊苷转化率为94.16%。
本发明中甜菊糖总苷的测定法法如下：
检测步骤：按照以下液相色谱条件检测每种糖苷的含量；
试剂：乙腈,在210nm下检测透光度＞95%；
标准品规格：
甜菊苷标准品：干重纯度＞99%；
莱鲍迪苷A标准品：干重纯度＞99%；
含有9种甜菊糖苷的基准溶液：包含甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、 莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷F、杜尔克苷A、悬钩子苷和甜菊双糖苷，用7:3的水乙腈溶液将含有 9种甜菊糖忒的标准溶液进行稀释，以便用来确定各个糖忒的出峰时间，标准品可在日本 Wako公司和美国ChromaDex公司买到。
标准品溶液的配制：精确称取100毫克甜菊苷标准品和100毫克莱鲍迪苷A标准品，分别放入100毫升的容量瓶中，然后加入7:3的水乙腈溶液进行溶解至100毫升刻度；
样品溶液的配制：样品一：精确称取100毫克作为原料的甜菊糖样品，放入100毫升的容量瓶中，然后加入7:3的水乙腊溶液进行溶解至100毫升刻度；样品二：精确称取100毫克反应并处理完成的葡萄糖基甜菊糖苷样品，放入100毫升的容量瓶中，然后加入7:3的水乙腊溶液进行溶解至100毫升刻度；
检测步骤：
在以下条件下注入样品溶液HPLC检测：
色谱柱:Agilent公司的Acclaim™ 120 C18 色谱柱或者Phenomenex公司的Luna5uC18（2）100A型色谱柱或者相当规格的色谱柱（长度：250毫米；内径：2.1毫米， 填料粒度：5μm）；
流动相：比例为30:70的乙腈和磷酸二氢钠缓冲液（规格：10mmol/L, pH值2. 6）的混合液；
磷酸钠缓冲液的配置方法：将1.2克磷酸二氢钠溶解,定容为1L升水溶液，加入磷酸将pH值调整到2.6；
流速：1毫升/每分钟；
检测器：210nm紫外检测；
色谱柱温度：40°C；
记录大约30分钟的检测图谱；
峰值识别和计算：
将样品溶液的出峰与含有9种甜菊糖苷的基准溶液的出峰时间对比，确定样品溶 液中各个出峰对应的糖苷；算出样品溶液中各种糖苷对应的峰面积,算出甜菊苷标准品溶 液和莱鲍迪苷A标准品溶液的峰面积；
按照以下公式，计算样品中甜菊苷与莱鲍迪苷A的百分比与之外的7种糖苷中每一种糖苷的百分比：
X%= [WS/W] x [fxAx/AS] xlOO
按照以下公式，计算样品中莱鲍迪忒A以及甜菊苷的百分比：
莱鲍迪苷A或甜菊苷 A %= [WR/W] x [AX/AR] xlOO
公式中：X代表每种糖苷；
Ws是甜菊忒标准品溶液中甜菊苷的干重（mg）；
WR是莱鲍迪苷A或甜菊苷标准品溶液中莱鲍迪苷A(甜菊苷）的干重（mg）；
AR是莱鲍迪苷A或甜菊苷标准品溶液中莱鲍迪苷A(甜菊苷）的峰面积；
W是样品溶液中样品的干重（mg）；
As是甜菊苷标准品溶液的峰面积；
Ax是样品溶液每种糖苷的峰面积；
fx是每种糖忒的分子量与甜菊忒分子量的比值：1.00（甜菊苷）,1. 20（莱鲍迪苷 A）,1.00（莱鲍迪苷 B）,1.18（莱鲍迪苷 C）,1.40（莱鲍迪苷 D）,1.16（莱鲍迪苷 F）,0.98（杜克尔苷 A简称DA）,0.80（悬钩子苷，简称DB）,0.80（甜菊双糖苷，简称STV）；
按照如上方法可以将甜菊苷、RA、总苷的含量计算出来。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
