基于聚乳酸、聚己内酯共聚物的可降解组织胶制备方法
技术领域
本发明涉及组织胶制造技术领域，尤其是基于聚乳酸、聚己内酯共聚物的可降解组织胶制备方法。
背景技术
生物材料是一类用于诊断、治疗和对机体细胞、组织和器官进行修复、替代以及再造的材料，广泛用于制备医用器件、器官修复、人工脏器、介入医疗制品以及药物释放系统等，直接关系到人民身体健康和生活品质，具有重要社会意义和经济效益。2019年世界医疗器械市场估计超过4500亿美元，其中生物材料及制品占了一半左右。随着人口的老龄化、人们对生活质量要求的提高，以及新医疗技术的需要，生物材料与制品国际市场未来将保持高速增长，发展趋势可与信息产业相比，成长世界经济的一个支柱产业。
生物可降解高分子，尤其是聚乳酸、聚羟基乙酸和聚己内酯等脂肪族聚酯，在生物医学领域具有十分广阔的应用前景。
另外，半月板损伤(meniscus%20injury)是膝部最常见的损伤之一，多见于青壮年，男性多于女性。国外报道内、外侧半月板损伤之比为4～5∶1，而国内报道相反，其比例为1∶2.5。美国从2005年到2011年，总共进行了387,833个半月板切除术，23,640个半月板修复和84,927例前交叉韧带重建，孤立的半月板修复总数显著增加，修复的发生率增加了一倍[1]，日本2015年的半月板手术总数为34,966例[2]，韩国在2010年进行的半月板切除术的总数为65,752例，2017年增加至74,088例[3]，我国没有这种全国性的统计，但是仅北京大学第三医院一家在2018年的前交叉韧带损伤手术就有2400多例。在我国，随着人们对健康的要求提高以及老龄化人群的增加，半月板损伤成为骨外科增长最快的患者群体。半月板损伤大体可分为非手术治疗及手术治疗，随着关节镜与半月板缝合修复系统的结合，使得半月板损伤微创缝合成为目前临床的主要治疗手段。但该治疗技术存在一定的局限性。首先是半月板部位的血运差（尤其是内侧），缝合这种“点固定”的方法，不利于纤维软骨细胞的爬行修复[4]；其次，术后需支具固定4到6周，存在下肢血栓及关节僵硬风险的同时，可能产生较明显的线结组织反应；再加上，目前这种“缝合修复系统”（FasT-Fix和RapidLoc）均为一次性使用器械[5]，价格昂贵，有些患者不得不放弃治疗，使其未来的生活质量受到严重影响。
半月板损伤是膝部最常见的损伤之一。目前临床治疗该类损伤的主要手段为半月板切除及手术缝合，但此类方法可能会导致患者病痛的复发甚至加重。因此生物医用组织胶成为治疗这类疾病的新型办法，医用组织胶在闭合创面的同时，可促进伤口自我愈合，实现人体组织的无痕修复。但是目前临床应用的组织胶Histoacryl有一定毒性，而且不能生物降解。
目前已经在临床应用的组织胶是德国贝朗医疗集团开发的Histoacryl胶水(单体N-丁基-2-丙烯酸氰），该组织胶是利用单体N-丁基-2-丙烯酸氰液体，与人体组织液接触后迅速聚合，变为多聚体，多聚体可形成一层固态薄膜，使伤口边缘紧紧粘合在一起，形成坚固可靠的伤口闭合，但氰基丙烯酸酯类材料的毒性限制了该类组织胶在体内的应用，因此仅局限用于皮肤伤口的闭合[6,7]。
发明内容
本发明为解决上述技术问题之一所采用的技术方案是：基于聚乳酸、聚己内酯共聚物的可降解组织胶，所述可降解组织胶的组分为所述共聚物，所述共聚物的化学分子结构为：
其中n、m均为大于等于1的自然数。
优选地，基于聚乳酸、聚己内酯共聚物的可降解组织胶制备方法，其特征在于：其制备步骤如下：
S1：在高温、真空条件下通过ε-己内酯和DL-丙交酯的本体开环聚合反应，合成PCL/PLA共聚物；
S2：PCL/PLA共聚物纯化。
优选地，在所述S1步骤中使用辛酸亚锡作为催化剂。
优选地，所述PCL/PLA共聚物纯化步骤为：所述聚合物通过溶解或沉淀法纯化，使用二氯甲烷作为溶剂和乙醇作为非溶剂进行纯化，真空干燥至恒重。
优选地，所述S2中的高温的温度范围为200℃-350℃。
优选地，所述ε-己内酯单体使用前经氢化钙干燥并蒸馏。
优选地，所述DL-丙交酯为丙交酯单体，其制备过程包括如下步骤：
a1：以乳酸为原料,将乳酸单体进行预聚合；
a2：缩聚脱水后产生聚乳酸低聚物；
a3：再以催化剂及高温、真空环境下解聚环化，得到丙交酯粗产物；
a4：使用乙酸乙酯溶剂，重结晶丙交酯单体三次，得到纯化白色丙交酯晶体。丙交酯的合成式如下：
借助核磁共振（NMR）、示差扫描量热法（DSC）手段检测单体样品的纯度。
以外消旋乳酸(DL-lactic acid)制备外消旋丙交酯(DL-lactide)，
左旋乳酸(L-lactic acid)制备左旋丙交酯(L-lactide)。
本发明的有益效果体现在：本共聚物在实际使用中具有双面粘合作用；具有良好的生物相容性，在一定时间内能够起到粘合作用；具有较好的粘弹性和持粘性，以及较高的剥离强度。
具体实施方式
下面对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
基于聚乳酸、聚己内酯共聚物的可降解组织胶，所述可降解组织胶的组分为所述共聚物，所述共聚物的化学分子结构为：
其中n、m均为大于等于1的自然数。
优选地，基于聚乳酸、聚己内酯共聚物的可降解组织胶制备方法，其特征在于：其制备步骤如下：
S1：在高温、真空条件下通过ε-己内酯和DL-丙交酯的本体开环聚合反应，合成PCL/PLA共聚物；
S2：PCL/PLA共聚物纯化。
优选地，在所述S1步骤中使用辛酸亚锡作为催化剂。
优选地，所述PCL/PLA共聚物纯化步骤为：所述聚合物通过溶解或沉淀法纯化，使用二氯甲烷作为溶剂和乙醇作为非溶剂进行纯化，真空干燥至恒重。
优选地，所述S2中的高温的温度范围为200℃-350℃。
优选地，所述ε-己内酯单体使用前经氢化钙干燥并蒸馏。
优选地，所述DL-丙交酯为丙交酯单体，其制备过程包括如下步骤：
a1：以乳酸为原料,将乳酸单体进行预聚合；
a2：缩聚脱水后产生聚乳酸低聚物；
a3：再以催化剂及高温、真空环境下解聚环化，得到丙交酯粗产物；
a4：使用乙酸乙酯溶剂，重结晶丙交酯单体三次，得到纯化白色丙交酯晶体。丙交酯的合成式如下：
借助核磁共振（NMR）、示差扫描量热法（DSC）手段检测单体样品的纯度。
以外消旋乳酸(DL-lactic acid)制备外消旋丙交酯(DL-lactide)，
左旋乳酸(L-lactic acid)制备左旋丙交酯(L-lactide)。
共聚物的[CL]/[LA]摩尔比设定为40/60，50/50和60/40，同样条件下合成[CL]/[LA]摩尔比为50/50的ε-己内酯和L-丙交酯的共聚物进行比较研究。
PCL/PLA共聚物的合成式如下：
借助核磁共振（NMR）、尺寸排阻色谱（SEC）、示差扫描量热法（DSC）、扫描电子显微镜（SEM）等方法对PCL/PLA共聚物进行表征，对聚合物进行化学组成、分子量、热性能和形态结构的测定。
共聚物制成的可降解组织胶的材料性能评价：
拉伸测试：
将共聚物制备成10×4×0.3mm3样品长条，采用动态机械分析（DMA），进行拉伸实验，测试共聚物拉伸强度及断裂伸长率。
初粘性试验：
根据GB-T 4852-2002 压敏胶粘带初粘性试验方法（滚球法），测试物体和材料粘性面之间以微小压力发生短暂接触时，材料对物体的粘附作用。将共聚物材料制成平面薄膜，切割成40mm、250mm以上长条形样品，贴附于倾斜角度为30o的平面上，使不同规定大小钢球滚过样品，测量其在样品上的滚动距离，评价材料初粘性的大小。
持粘性试验：
根据GBT 4851-2014 胶粘带持粘性的试验方法，测试材料抵抗平行剪切外力所引起的粘接表面破坏的能力。将材料制备成25×70mm尺寸样品长条，长条一端粘在在试样板上，滚压充分贴合，使样品垂直挂置，在样品另一端悬挂一定重量的砝码，记录样品从试样板上完全分离的时间以及规定时间内下滑的距离，测试材料持粘性大小。
剥离强度试验：
根据GBT 2792-2014 胶粘带剥离强度的试验方法，测试单位宽度的材料以一定角度和速率从平面剥离所需要的力。将样品长条粘在不锈钢板上滚压充分贴合，不锈钢板固定在拉力试验机夹具上，试验机另一个夹具加住样品长条一端，以180o剥离角度，规定速度拉开样品长条，计算材料剥离强度。
共聚物制成的可降解组织胶的材料降解研究：
将4组PCL/PLA共聚物制备成10×10×0.4mm的薄膜样品，在 37℃恒温振荡器中进行体外降解实验，降解介质为 pH=7.4 的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，加入NaN3抑制细菌生长。在预定降解时间点取出样品，以蒸馏水洗涤，滤纸吸收薄膜表面水分并称重，真空干燥至恒重，测定共聚物吸水及失重百分比。采用NMR测试共聚物组成的变化，SEC测试共聚物分子量变化，DSC测试材料热性能变化，SEM测试表面形态变化，综合评价材料体外降解速度。
安全性评价：
细胞相容性：
MTT实验，将共聚物溶于二氯甲烷中配成10mg/mL溶液，滴涂于血盖片上，常温下过夜风干，再真空干燥24小时，制成薄膜样品，紫外灭菌。以DMEM培养基为浸提介质，按液体/膜面积比1.0 mL/6 cm2，在37℃无菌条件下浸提样品72h，制备浸提液。小鼠成纤维细胞L929与浸提液共培养。采用MTT法计算细胞的相对增殖度，评价材料的细胞毒性。
血液相容性：
同上述方法制备材料薄膜样品及浸提液，取新鲜兔血，分别进行溶血实验、血浆复钙实验及动态凝血时间实验，计算材料溶血率，检测血浆复钙时间延长情况及动态凝血时间，综合评估材料血液相容性。
组织相容性：
将共聚物制成薄膜，选取健康Wistar小鼠，每只鼠麻醉后分别于颈背部消毒备皮，于皮下近中线处植入共聚物薄膜。既定时间处死小鼠，取出皮下薄膜及其周围组织，组织切片后在光镜下观察周围组织的炎性反应、增生情况及纤维囊的形成情况，评估材料组织相容性。
材料的合成在实验室规模的基础上，根据实际需要，通过真空反应釜，一般5-10升，实现材料合成的中试。
合成一系列高分子量的聚己内酯/聚乳酸共聚物（PCL/PLA），制备用于半月板损伤治疗的新型可降解组织胶。通过测试材料的力学性能、粘性、降解时间及生物相容性，评估该组织胶在临床应用上的可行性。
聚己内酯/聚乳酸共聚物的合成：
分子量5万以上，分布系数2.0以下，密度 1.2-1.3 g/cm3，残余单体含量小于2%化学组成接近投料比。
聚己内酯/聚乳酸共聚物的性能测试，体外降解实验：
共聚物表现出较好的粘弹性和持粘性，以及较高的剥离强度，均达到临床应用标准。共聚物体外降解时间在14-16周内。
聚己内酯/聚乳酸共聚物的生物相容性，动物实验：
根据国家为标准GB/T16886.5体外细胞毒性试验、国家标准GB/T16886.4 与血液相互作用试验、GB/T 16886.6 植入后局部反应试验等标准，在细胞相容性实验中，细胞相对活力>80%；血液相容性实验中，材料溶血率<5%，血浆复钙时间较阳性对照延长40%，内源性凝血因子激活程度较低；在组织相容性实验中，小鼠周围组织无水肿、充血、感染及坏死情况，纤维囊壁较薄且厚度稳定，质地韧。
材料合成完成中试，临床实验准备：
批量合聚合物，分子量5万以上，分布系数2.0以下，密度 1.2-1.3 g/cm3，残余单体含量小于2%化学组成接近投料比。
本可降解组织胶能够满足半月板的粘合的以下条件：①双面粘合作用，即对半月板和骨面均具有粘附性（类似生活中的胶水作用），闭合损伤造成的半月板与骨面的脱离——以便后期软骨纤维细胞的爬行修复；②具有良好的生物相容性，该生物胶需要在无菌且狭小的损伤空间使用，因此必须具有良好的生物相容性以满足体内植入标准，不造成组织对其的排斥反应；③体内可降解性：生物胶在一定时间内起到粘合作用的同时，对纤维软骨细胞的爬行提供桥梁作用，随着纤维软骨对半月板的修复逐渐降解，使半月板实现自身的完美修复。④缩短愈合周期：在缩短患肢制动时间的基础上，大大压缩患者的住院治疗时间，减少并发症。同时，降低患者费用支出。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中；对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。
