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发酵法生产多聚唾液酸及其提取精制方法

2021-02-26 18:08:21

发酵法生产多聚唾液酸及其提取精制方法

  技术领域

  本发明涉及生物工程技术领域,特别是涉及一种发酵法生产多聚唾液酸及其提取精制方法。

  背景技术

  微生物发酵法生产多聚唾液酸(PSA)已有很多研究和尝试。利用大肠杆菌天然菌种即可以完成。多聚唾液酸本身有药品缓释剂,免疫佐剂,药物前体等多种用途。而且进一步水解可以得到单体N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac),后者是重要的食品和药品原料。

  发酵法生产多聚唾液酸目前已有文献报道,专利CN 103361283公开了采用菌株CGMCC No.5585 利用葡萄糖发酵生产多聚N-乙酰神经氨酸的方法。但使用该方法多聚N-乙酰神经氨酸的产量最高只能达到6g/L。

  专利申请CN201811124478公开了一种发酵法产聚唾液酸的方法,但是其采用的菌种不同,为CCTCC No. M2018103,且发酵方案与本专利申请CGMCC No.5585有明显的不同。该CCTCC No. M2018103发酵方案采用山梨醇,而CGMCC No.5585不需要山梨醇;CCTCC No.M2018103采用乙酰氨基葡萄糖而本专利CGMCC No.5585为普通的葡萄糖,氮源方面CCTCCNo. M2018103采用蛋白胨和而本专利CGMCC No.5585采用最简单便宜的玉米浆,CCTCC No.M2018103需要添加维生素而CGMCC No.5585无需单独添加任何维生素。所述发酵时间CCTCCNo. M2018103超过40小时,而CGMCC No.5585只需不超过20小时;另外,作为食品原料,CCTCC No. M2018103发酵采用的乙酰氨基葡萄糖,CTAB,均不在国家规定的食品添加剂名录GB2760-2014当中,不属于允许使用的食品原料或食品加工助剂,而CGMCC No.5585采用葡萄糖,玉米浆和氨水,均为GB2760-2014允许使用的食品原料或食品加工助剂。专利申请CN201811125667公开的发酵法生产聚唾液酸与CN201811124478所公开的内容相似,如上所述,与本专利CGMCC No.5585的发酵工艺存在显著不同。专利申请CN201811219956公开了一种在发酵过程中添加树脂吸附剂的方法,本专利不采用该方法,在发酵过程中不使用任何对聚唾液酸具有吸附,耦合,络合的物质。菌株采用经过抗生素抗性鉴定和大肠杆菌毒力鉴定的CGMCC No.5585。

  发明内容

  本发明主要解决的技术问题是提供一种发酵法生产多聚唾液酸及其提取精制方法,方法简洁,节省了成本,降低了能耗,得到的多聚唾液酸纯度高、不含内毒素,可作为生产食品、化妆品、药物的原料。

  为解决上述技术问题,本发明采用的一个技术方案是:提供一种发酵法生产多聚唾液酸的方法,包括以下步骤:

  (1)在种子罐的基础培养基中接种体积百分比为2%-2.5%的大肠杆菌SA-8,发酵培养获得种子培养液;

  (2)将种子培养液接种于含上述基础培养基的发酵罐中,发酵起始阶段通普通无菌空气,采用氨水将pH控制在6.6-6.8,36-38℃下进行发酵培养,并流加碳源,优选地,流加葡萄糖;

  (3)发酵6小时后进入对数生长期,此时采用纯氧与空气混合通气,6-10小时温度仍然控制在36-38℃,用氨水将pH控制在6.6-6.8;10小时以后将温度降为33-35℃,用氨水将pH控制在6.2-6.5,继续补碳源发酵;

  (4)发酵至17小时后采用Ca(OH)2溶液调节pH 值至8.0-8.5,并降温至18-22℃;然后停止搅拌,持续保持通普通空气1.8-2.2小时,至19-21小时结束发酵过程,最终发酵制得多聚唾液酸,产量在10克/升以上。

  在本发明一个较佳实施例中,步骤(1)中所述的大肠杆菌SA-8的保藏号为CGMCCNo.5585,该菌株具有高产聚唾液酸的能力,10立方大生产发酵水平最高已超过10g/L。经抗生素敏感鉴定,对β内酰胺类(苄基青霉素,包括氨苄和羧苄),氨基糖甙类(链霉素,卡那霉素,壮观霉素等),四环素类(四环素),氯霉素类(氯霉素)均非常敏感。毒力基因测序显示不含有stx1、stx2,eaeA、aggR、ipaH、It、stlb等致泻性大肠埃希菌携带的重要毒力基因;目前该菌株在中国普通微生物菌种保藏中心已经进行专利保藏,保藏号为CGMCC No. 5585,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC) ;地址:北京市朝阳区北辰西路1 号院;保藏日期:2011 年12 月13 日,分类命名及拉丁学名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)

  在本发明一个较佳实施例中,步骤(1)中基础培养基的碳源为葡萄糖,葡萄糖含量为10-35克/升。

  在本发明一个较佳实施例中,步骤(2)中流加的碳源为葡萄糖。

  在本发明一个较佳实施例中,在接种种子培养液后开始流加葡萄糖,前6-7小时流加速度维持葡萄糖在发酵液中的浓度为2-3克/升,在6小时后发酵进入对数生长期,到发酵8-12小时流加速度维持葡萄糖在发酵液中的浓度为5-8克/升;发酵13-17小时葡萄糖流加速度降低,使葡萄糖在发酵液中的浓度为2-3克/升,17小时后停加葡萄糖。

  在本发明一个较佳实施例中,步骤(2)中氨水的质量百分比浓度为20%-33%,Ca(OH)2溶液的质量百分比浓度为0.5%-0.6%。

  在本发明一个较佳实施例中,步骤(2)中采用Ca(OH)2溶液调节pH 值8.0-8.5。

  在本发明一个较佳实施例中,步骤(3)中采用纯氧与空气混合通气时纯氧的浓度>96%,体积比例为纯氧:空气=0.5-1:1。

  为解决多聚唾液酸的提取技术问题,本发明提供了一个提纯聚唾液酸的实施例,包括以下步骤:

  (1)以大肠杆菌CGMCC No.5585 的发酵液为原料,发酵过程中形成的为多聚唾液酸氨和钙盐,然后用弱碱性阴离子交换树脂变为聚唾液酸钠;

  (2)聚唾液酸钠使用70000Dalton 超滤膜超滤,采用纯水洗涤将pH调整至7.2以下后,弃去滤液,保留超滤后的浓缩液;

  (3)上述多聚唾液酸钠的浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇,静置降温,用质量百分比浓度为70%以上乙醇洗涤后,然后减压蒸馏或冷冻真空干燥除去乙醇,获得聚唾液酸成品。

  本发明的有益效果是:

  1、本发明的多聚唾液酸的发酵产量可以达到10g/L,高于现有技术的平均水平,特别适合于于工业化发酵生产多聚唾液酸;

  2、本发明的发酵原料使用便宜的葡萄糖代替较贵的山梨醇,可以进一步降低生产成本;

  3、本发明采用通入一定比例的纯氧,中途降温,发酵后期用Ca(OH)2调节pH,大大提高了发酵产量;

  4、本发明的提纯方法采用离子交换,首先经过弱碱性阴离子交换树脂将产品变为聚唾液酸钠后,氯化钠溶液洗脱,不再采用吸附树脂和乙醇洗脱,节省了成本,降低了能耗。

  5、本发明的提纯精制方法,制取获得的高纯度多聚唾液酸钠HPLC纯度98%以上,产率可达10克/升的高纯多聚唾液酸。

  附图说明

  为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图,其中:

  图1是本发明的多聚唾液酸的紫外吸收光谱,样品:PSA水溶液波长扫描范围:210-400nm;

  图2是本发明的多聚唾液酸的红外图谱;

  图3是本发明的多聚唾液酸的高效液相谱图。

  具体实施方式

  下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。

  实施例一

  发酵菌种为中国科学院微生物研究所工业微生物研究室诱变筛选的大肠杆菌SA-8,其专利保藏号为 CGMCC NO.5585。

  发酵法生产多聚唾液酸的方法,包括以下步骤:

  (1)在种子罐的基础培养基中接种体积百分比为2%的大肠杆菌SA-8,发酵培养获得种子培养液,种子罐采用1000升发酵。所用的基础培养基为葡萄糖25g/L,硫酸铵5g/L,酪蛋白胨15g/L,磷酸氢二钾20g/L,硫酸镁0.4g/L,混合均匀后,通蒸汽灭菌。至121℃后,维持罐压0.09MPa,灭菌30 分钟。灭菌过程需用200rpm 连续搅拌。待冷却后,接种9 升菌体培养液,37℃培养12 小时获得种子培养液。

  (2)将种子培养液接种于含上述基础培养基的发酵罐中,通空气,采用氨水将pH控制在6.6-6.8,37℃下进行发酵培养,并流加碳源,发酵罐采用10000 升(10m³)发酵,基础培养基为葡萄糖25g/L,硫酸铵5g/L,酪蛋白胨15g/L,磷酸氢二钾20g/L,硫酸镁0.4g/L,接种上述种子培养液。

  (3)在接种种子培养液后开始流加葡萄糖,前6小时流加速度维持葡萄糖在发酵液中的浓度为2-3克/升,发酵温度37℃,用质量百分比浓度为25%氨水将pH控制在6.6-6.8,6小时后,通纯氧,纯氧与空气体积比为0.75:1,温度仍然控制在37℃,pH控制在6.6-6.8;10小时后,纯氧与空气体积比为1:1,pH控制为6.3-6.5,温度由37℃降为34℃;在6小时到发酵12小时流加速度维持葡萄糖在发酵液中的浓度为5-8克/升;从12小时起开始降糖浓度,使葡萄糖在发酵液中的浓度为2-3克/升,17小时后停加葡萄糖;发酵17小时后采用质量百分比浓度为0.5%的Ca(OH)2溶液调节pH 值8.0-8.5,停止搅拌,并降温至20℃,此时停止纯氧,改用无菌空气,维持通气2小时,到20小时结束发酵过程。

  (4)发酵结束后,测定发酵收获期的PSA 产率,使用间苯二酚法测得发酵收获期的PSA产率平均为10g/L。

  实施例二

  使用实施例1 获得的发酵液。按下述步骤进行多聚唾液酸的提取精制:

  (1)菌液分离:200纳米陶瓷膜除去菌体,清液先经过弱碱性阴离子交换树脂将多聚唾液酸铵盐变为聚唾液酸钠;

  (2)去除小分子杂质:经过离子交换后的聚唾液酸钠溶液用孔径70000Dalton 膜系统超滤,浓缩大分子;并用纯水将浓缩的聚唾液酸钠溶液洗涤至pH 7.2以下,滤过的废液舍弃,保留浓缩液。

  (3)乙醇沉淀PSA:在浓缩洗涤好的多聚唾液酸钠溶液中加入三倍体积的无水乙醇,静置降温至8℃以下,维持1 小时后,离心收集多聚唾液酸沉淀;沉淀用质量百分比浓度70%乙醇洗涤2 次,然后减压蒸馏或冷冻真空干燥除去乙醇,获得聚唾液酸成品。

  本发明的多聚唾液酸的核磁共振谱,500Hz,D2O,碳原子的化学位移,如表1所示。

  表1

  对分离得到的聚唾液酸进行红外光谱分析,聚唾液酸红外光谱在3358 cm-1处有宽而强的吸收,示有-OH的O-H键和-NH-的N-H键伸缩振动;在1626 cm-1处有中强吸收,示有-COO-和-NHCOCH3的C=O键的伸缩振动和非对称伸缩振动,以及N-H键的弯曲振动;在1384 cm-1处有中等吸收,示有-COO-的C-O键伸缩振动和C=O的对称伸缩振动;在1080 cm-1处有强吸收,示有C-O-C(糖环)的伸缩振动。这些基团均为乙酰氨基多糖的特征基团。

  多聚唾液酸的HPLC图如图3所示,HPLC方法如下:色谱柱为ACE 5AQ C18:250mm×4.6mm;流动相为5Mm H2SO4(A)-甲醇(B),梯度洗脱,洗脱时间20min,流速为1mL/min,进样量为10μL;柱温:35℃。结果可以参见附图3,由图计算可以得到本发明实施例制得的高纯度多聚唾液酸钠,HPLC纯度98%以上,比旋光度+15-+17度,钠离子含量低于8.5%,多聚唾液酸产率可达10克/升以上。

  本发明发酵法生产多聚唾液酸的方法及提取精制方法的有益效果是:本发明的多聚唾液酸的发酵产量可以达到10g/L,高于现有技术的平均水平,特别适合于于工业化发酵生产多聚唾液酸;本发明的发酵原料使用便宜的葡萄糖代替较贵的山梨醇,可以进一步降低生产成本;本发明采用通入一定比例的纯氧,中途降温,发酵后期用Ca(OH)2调节pH,大大提高了发酵产量;本发明的提纯方法采用弱碱性阴离子交换树脂特异性吸附聚唾液酸阴离子而不吸附小分子阴离子。经过弱碱性阴离子交换树脂将产品变为聚唾液酸钠后,不再使用吸附树脂和乙醇洗脱而改用氯化钠溶液洗脱,节省了成本,降低了能耗;本发明的提纯精制方法,制取获得的高纯度多聚唾液酸钠HPLC纯度98%以上,产率可达10克/升的高纯多聚唾液酸。以本发明采用的菌种和方法获得的多聚唾液酸水解后生产的单体唾液酸符合国家卫生健康委生产新食品原料“N-乙酰神经氨酸”的准入标准。

  以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其它相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。

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