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用于废物处理的微生物

2021-02-01 23:13:06

用于废物处理的微生物

  相关申请的交叉引用

  本申请在美国法典第35篇第119(e)条下要求2018年6月20日提交的美国专利申请号62/687,610和2017年11月2日提交的美国专利申请号62/580,926的权益和优先权,它们二者的整个公开内容通过引用并入本文。

  技术领域

  本发明涉及用一种或多种微生物处理废物,其目的包括但不限于降解废物、废物的生物修复、增强废物稳定性、减少废物中的污染物、减少废物中的气味、减少废物中的有机物和它们的组合。更具体地,本发明涉及分离的芽孢杆菌(Bacillus)菌株,以及具有这些菌株的所有鉴定特征的菌株,和它们的组合,用于包括上述用途的用途。

  发明背景和概述

  本发明涉及用于废物处理的微生物,所述废物处理包括但不限于生物修复工业废物、市政固体废物、垃圾填埋场废物、土壤废物、废水、堆肥废物、受污染的地下水、来自废物的渗滤液、含聚合物的废物、含烃废物、含塑料的废物、含聚乙烯的废物、含高密度聚乙烯的废物和含塑料袋的废物;以及它们的使用方法(例如,受污染的废物、土壤和水的生物强化)。微生物菌株(诸如芽孢杆菌菌株)产生有益酶的能力及其抗微生物活性和环境相容性,已经导致这些微生物菌株在废物处理中的应用。例如,有益的微生物菌株可以用于重建对环境有益的细菌的平衡并降解废物中的有害有机化合物。

  由于塑料已经生产了不到200年,因此几乎没有关于分解速率的信息。聚合物结晶度可以限制链移动并降低降解剂(包括微生物酶)的利用率和增加疏水性。通过紫外光降解、热氧化或通过微生物或真菌-生物表面活性剂/酶产生以及生物膜形成,可以引发塑料氧化和降解。在弱化的聚合物链的氧化和断裂之后,微生物和真菌能够代谢塑料并将碳转化为二氧化碳。

  申请人已经开发了芽孢杆菌菌株和它们的组合,其可用于废物处理、废物降解(包括含塑料的废物)和控制废物的有害影响,例如通过除去污染物。这些菌株可以增加塑料废物(例如高密度聚乙烯)的腐败速率,降解市政固体废物,增强废物稳定性,减少废物中的污染物,减少化学需氧量,减少废物中的有机物(例如,烃),减少废物中的气味(例如,硫化氢和硫酸盐)等。在一个实施方案中,提供了一种处理废物以除去污染物的方法。该方法包括使所述废物与有效量的分离的芽孢杆菌菌株接触和除去所述污染物,所述菌株选自:芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRLNo. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRLNo. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  在另一个实施方案中,提供了一种控制废物的有害影响的方法。该方法包括使所述废物与有效量的分离的芽孢杆菌菌株接触和控制所述废物的有害影响,所述菌株选自:芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112(NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310(NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  在各种其它实施方案中,提供了商业包装、废物添加剂和组合物。商业包装、废物添加剂和组合物包含分离的芽孢杆菌菌株,其选自:芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No.B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  以下条款及其组合提供了本文描述的本发明的各种另外的示例性方面。在本专利申请的任何其它部分(包括标题为“示例性实施方案的详细描述”的部分和实施例)中描述的各种实施方案适用于在以下编号的条款中描述的本发明的以下实施方案中的任一个。

  1. 一种处理废物以除去污染物的方法,所述方法包括使所述废物与有效量的分离的芽孢杆菌菌株接触和除去所述污染物,所述菌株选自:芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No.B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No.B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  2. 条款1的方法,其中所述废物选自:工业废物、市政固体废物、垃圾填埋场废物、土壤废物、废水、堆肥废物、受污染的地下水、来自废物的渗滤液、含聚合物的废物、含烃废物、含塑料的废物、含聚乙烯的废物、含高密度聚乙烯的废物和含塑料袋的废物。

  3. 条款1或2的方法,其中所述污染物是塑料。

  4. 条款1-3中的任一个的方法,其中所述污染物是聚乙烯。

  5. 条款4的方法,其中所述污染物是高密度聚乙烯。

  6. 条款1-5中的任一个的方法,其中所述污染物是有机化合物。

  7. 条款6的方法,其中所述有机化合物通过降解除去。

  8. 条款1-2中的任一个的方法,其中所述污染物是无机化合物。

  9. 条款1-8中的任一个的方法,其中所述芽孢杆菌菌株中的至少一种具有抗微生物活性。

  10. 条款9的方法,其中所述抗微生物活性是针对选自以下的细菌:大肠杆菌(E. coli)、沙门氏菌(Salmonella)、葡萄球菌(Staphylococcus)、肠球菌(Enterococcus)、梭状芽胞杆菌(Clostridia)、弯曲杆菌(Campylobacter)和它们的组合。

  11. 条款1-10中的任一个的方法,其中所述芽孢杆菌菌株产生选自以下的酶:水解酶、氧化还原酶、半乳糖苷酶、NSPase、植酸酶、阿拉伯木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、酯酶、脂肪酶和它们的组合。

  12. 条款11的方法,其中所述酶是酯酶。

  13. 条款11的方法,其中所述酶是脂肪酶。

  14. 条款1-13中的任一个的方法,进一步包括用另一种细菌菌株处理废物,所述另一种细菌菌株选自:另一种芽孢杆菌菌株、乳酸细菌菌株和它们的组合。

  15. 条款1-14中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No.B-67472)或具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株。

  16. 条款1-14中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No.B-67473)或具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株。

  17. 条款1-14中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No.B-67471)或具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株。

  18. 条款1-14中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No.B-67474)或具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株。

  19. 条款1-14中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No.B-67472)。

  20. 条款1-14中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No.B-67473)。

  21. 条款1-14中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No.B-67471)。

  22. 条款1-21中的任一个的方法,其中所述芽孢杆菌菌株的有效量是约1.0 x102 CFU/克废物至约1.0 x 106 CFU/克废物。

  23. 条款1-21中的任一个的方法,其中所述芽孢杆菌菌株的有效量是约1.0 x102 CFU/克废物至约1.0 x 104 CFU/克废物。

  24. 条款1-21中的任一个的方法,其中所述有效量是大于约1.0 x 102 CFU/克废物至约1.0 x 103 CFU/克废物的量。

  25. 条款1-24中的任一个的方法,进一步包含使所述废物与选自以下的酶接触:水解酶、氧化还原酶、半乳糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、酯酶、淀粉酶、半纤维素酶、阿拉伯木聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶、NSPase、植酸酶和它们的组合。

  26. 一种控制废物的有害影响的方法,所述方法包括使所述废物与有效量的分离的芽孢杆菌菌株接触和控制所述废物的有害影响,所述菌株选自:芽孢杆菌菌株8992(NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  27. 条款26的方法,其中所述废物选自:工业废物、市政固体废物、垃圾填埋场废物、土壤废物、废水、堆肥废物、受污染的地下水、来自废物的渗滤液、含聚合物的废物、含烃废物、含塑料的废物、含聚乙烯的废物、含高密度聚乙烯的废物和含塑料袋的废物。

  28. 条款26或27的方法,其中所述有害影响由塑料造成。

  29. 条款26-28中的任一个的方法,其中所述有害影响由聚乙烯造成。

  30. 条款29的方法,其中所述有害影响由高密度聚乙烯造成。

  31. 条款26-30中的任一个的方法,其中所述有害影响由有机化合物造成。

  32. 条款31的方法,其中所述有机化合物通过降解除去。

  33. 条款26-27中的任一个的方法,其中所述有害影响由无机化合物造成。

  34. 条款26-33中的任一个的方法,其中所述芽孢杆菌菌株中的至少一种具有抗微生物活性。

  35. 条款34的方法,其中所述抗微生物活性是针对选自以下的细菌:大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、肠球菌、梭状芽胞杆菌、弯曲杆菌和它们的组合。

  36. 条款26-35中的任一个的方法,其中所述芽孢杆菌菌株产生选自以下的酶:水解酶、氧化还原酶、半乳糖苷酶、NSPase、植酸酶、阿拉伯木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、酯酶、脂肪酶和它们的组合。

  37. 条款36的方法,其中所述酶是酯酶。

  38. 条款36的方法,其中所述酶是脂肪酶。

  39. 条款26-38中的任一个的方法,进一步包括用另一种细菌菌株处理废物,所述另一种细菌菌株选自:另一种芽孢杆菌菌株、乳酸细菌菌株和它们的组合。

  40. 条款26-39中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株8992 (NRRLNo. B-67472)或具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株。

  41. 条款26-39中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株2112 (NRRLNo. B-67473)或具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株。

  42. 条款26-39中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株2310 (NRRLNo. B-67471)或具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株。

  43. 条款26-39中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株4954 (NRRLNo. B-67474)或具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株。

  44. 条款26-39中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株8992 (NRRLNo. B-67472)。

  45. 条款26-39中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株2112 (NRRLNo. B-67473)。

  46. 条款26-39中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株2310 (NRRLNo. B-67471)。

  47. 条款26-39中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株4954 (NRRLNo. B-67474)。

  48. 条款26-47中的任一个的方法,其中所述芽孢杆菌菌株的有效量是约1.0 x102 CFU/克废物至约1.0 x 106 CFU/克废物。

  49. 条款26-47中的任一个的方法,其中所述芽孢杆菌菌株的有效量是约1.0 x102 CFU/克废物至约1.0 x 103 CFU/克废物。

  50. 条款26-49中的任一个的方法,进一步包含使所述废物与选自以下的酶接触:水解酶、氧化还原酶、半乳糖苷酶、NSPase、植酸酶、阿拉伯木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、酯酶、脂肪酶和它们的组合。

  51. 一种商业包装,其包含分离的选自以下的芽孢杆菌菌株:芽孢杆菌菌株8992(NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  52. 一种废物添加剂,其包含分离的选自以下的芽孢杆菌菌株:芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  53. 一种组合物,其包含分离的选自以下的芽孢杆菌菌株:芽孢杆菌菌株8992(NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  54. 条款51-53中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株造成废物中有机化合物的降解或无机化合物的除去。

  55. 条款51-54中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株呈浓缩物的形式。

  56. 条款51-54中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株呈超浓缩物的形式。

  57. 条款51-56中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株呈干燥形式。

  58. 条款51-57中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株呈丸粒形式。

  59. 条款51-56中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述菌株呈选自粉末、液体和丸粒形式的形式。

  60. 条款51-59中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,进一步包含用于所述芽孢杆菌菌株的载体。

  61. 条款60的商业包装、添加剂或组合物,其中所述载体选自盐、糊精和它们的组合。

  62. 条款51-61中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其在袋中。

  63. 条款62的商业包装、添加剂或组合物,其中所述袋是塑料袋。

  64. 条款51-63中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其进一步包含所述芽孢杆菌菌株中的一种或多种的使用说明书。

  65. 条款51-64中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其在20-磅袋中。

  66. 条款51-64中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其在50-磅袋中。

  67. 条款51-57或60-66中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株呈粉末形式。

  68. 条款51-56中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株呈液体形式。

  69. 条款51-68中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株是在用于商业使用的容器中。

  70. 条款69的商业包装、添加剂或组合物,其中所述容器包括塑料。

  71. 条款69的商业包装、添加剂或组合物,其中所述容器包括纸。

  72. 条款51-71中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,进一步包含粘合剂。

  73. 条款72的商业包装、添加剂或组合物,其中所述粘合剂选自粘土、酵母细胞壁组分、硅酸铝和葡聚糖或它们的组合。

  74. 条款51-73中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株降解塑料。

  75. 条款51-74中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株降解高密度聚乙烯。

  76. 条款26-50中的任一个的方法,其中所述有害影响是气味且所述气味受到控制。

  77. 条款76的方法,其中所述气味由硫酸盐和硫化氢(H2S)产生造成。

  78. 一种包含至少四层的垃圾填埋场模拟器,所述层包括土壤层、废物和土壤层、引流层和过滤器。

  79. 条款78的垃圾填埋场模拟器,其中所述土壤层是压实的土壤。

  80. 条款78或条款79的垃圾填埋场模拟器,其中所述引流层是颗粒状的。

  81. 条款78-80中的任一个的垃圾填埋场模拟器,其中所述过滤器是土工织物过滤器。

  82. 条款78-81中的任一个的垃圾填埋场模拟器,进一步包含试验样品。

  83. 条款82的垃圾填埋场模拟器,其中所述试验样品是用于降解塑料的细菌,且其中在所述废物和土壤层中的废物包含含塑料的废物。

  84. 条款83的垃圾填埋场模拟器,其中所述塑料是聚乙烯。

  85. 条款78-84中的任一个的垃圾填埋场模拟器,其中所述土壤层是顶层,所述过滤器是底层,所述废物和土壤层以及所述引流层在所述土壤层和所述过滤器之间,所述废物和土壤层在所述土壤层和所述引流层之间,且所述引流层在所述过滤器与所述废物和土壤层之间。

  86. 条款82-85中的任一个的垃圾填埋场模拟器,用于测试试验样品是否能够降解塑料。

  87. 条款82-86中的任一个的垃圾填埋场模拟器,用于测试试验样品能够多快地降解塑料。

  88. 条款83-87中的任一个的垃圾填埋场模拟器,其中所述塑料选自聚乙烯(PE)、聚氯乙烯(PVC)、聚氨酯(PUR)、聚苯乙烯(PS)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚烯烃(PO)、环氧树脂、弹性体、热塑性物质、基于生物的塑料、可生物降解的塑料和复合塑料。

  89. 一种测试试验样品是否可以从垃圾填埋场除去污染物或控制垃圾填埋场中的废物的有害影响的方法,所述方法包括下述步骤:使所述试验样品与垃圾填埋场模拟器接触,其中所述垃圾填埋场模拟器包含至少四层,所述四层包括土壤层、废物和土壤层、引流层和过滤器。

  90. 条款89的方法,其中所述土壤层是压实的土壤。

  91. 条款89或条款90的方法,其中所述引流层是颗粒状的。

  92. 条款89-91中的任一个的方法,其中所述过滤器是土工织物过滤器。

  93. 条款89-92中的任一个的方法,其中所述试验样品是细菌菌株。

  94. 条款93的方法,其中所述方法用于测试所述试验样品是否可以降解塑料且其中在所述废物和土壤层中的废物包含含塑料的废物。

  95. 条款94的方法,其中所述塑料是聚乙烯。

  96. 条款89-95中的任一个的方法,其中所述土壤层是顶层,所述过滤器是底层,所述废物和土壤层以及所述引流层在所述土壤层和所述过滤器之间,所述废物和土壤层在所述土壤层和引流层之间,且所述引流层在所述过滤器与所述废物和土壤层之间。

  97. 条款89-96中的任一个的方法,用于测试试验样品能够多快地降解塑料。

  98. 条款94-97中的任一个的方法,其中所述塑料选自聚乙烯(PE)、聚氯乙烯(PVC)、聚氨酯(PUR)、聚苯乙烯(PS)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚烯烃(PO)、环氧树脂、弹性体、热塑性物质、基于生物的塑料、可生物降解的塑料和复合塑料。

  99. 条款89-93中的任一个的方法,用于测试试验样品是否能够减少垃圾填埋场中的气味。

  100. 条款99的方法,其中所述气味由H2S造成。

  101. 条款1-14或22-25中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株4954(NRRL No. B-67474)。

  102. 条款89的方法,其中所述废物是市政固体废物混合物。

  103. 条款89的方法,其中所述土壤层包含合成的渗滤液。

  104. 条款11或36的方法,其中所述酶是淀粉酶。

  105. 条款11或36的方法,其中所述酶是木聚糖酶。

  106. 条款11或36的方法,其中所述酶是纤维素酶。

  107. 条款11或36的方法,其中所述酶是蛋白酶。

  108. 条款1、2、9-25、26-27、34-50、101或104-107中的任一个的方法,其中所述废物是来自垃圾填埋场的渗滤液,且所述芽孢杆菌菌株可以作为繁殖物加入所述来自垃圾填埋场的渗滤液以当将所述渗滤液应用回垃圾填埋场时增加至所述垃圾填埋场的剂量率。

  109. 条款1、2、3-5、9-25、26-30、34-50、101或104-107中的任一个的方法,其中将所述芽孢杆菌菌株的孢子注入塑料中。

  110. 条款11或36的方法,其中所述酶是氧化还原酶。

  111. 条款11或36的方法,其中所述酶是半乳糖苷酶。

  112. 条款11或36的方法,其中所述酶是NSPase。

  113. 条款11或36的方法,其中所述酶是植酸酶。

  114. 条款11或36的方法,其中所述酶是阿拉伯木聚糖酶。

  115. 条款11或36的方法,其中所述酶是半纤维素酶。

  116. 条款11或36的方法,其中所述酶是水解酶。

  附图简述

  图1A和1B是对比在对照样品制品中温育的高密度聚乙烯(HDPE)条(1A)和在处理-1样品制品介质中温育的HDPE条(1B)的结构生理学的SEM图像,其中与1A中不存在黑点相比,1B的生理学显示了黑点或空腔。

  图2A和2B是对比在对照样品中温育的HDPE条(2A)或在处理-2样品制品中温育的HDPE条(2B)的结构生理学的SEM图像,并将二者在兼性生物反应器垃圾填埋场模拟器中温育,其中2B显示出与2A中的对照样品相比增加的空化。

  图3是垃圾填埋场模拟器的组构的示意图。

  图4A-C是SEM图像,其显示了与芽孢杆菌微生物一致的在HDPE膜上的所有检查区域中观察到的约1-2 μm长的棒状颗粒。

  图5显示了三种样品制品对基本培养基中的HDPE样品的平均降解百分比(n = 4,排除了离群值,p=0.0091)。

  图6A和6B显示了在基本培养基中的初始重量和最终重量之间的HDPE平均差异(mg)(p=0.047)和三种样品制品对基本培养基中的HDPE样品的平均降解百分比(p=0.014)。

  图7A和7B显示了在垃圾填埋场模拟器中的初始和最终HDPE重量之间的平均差异(mg)和在垃圾填埋场模拟器中的HDPE的平均降解百分比。

  图8显示了在模拟垃圾填埋场环境中温育2个月以后COD的渗滤液减少(第2-8周)。

  图9显示了在模拟垃圾填埋场环境中温育2个月以后硫酸盐的渗滤液减少(第3-8周)。

  图10显示了凝胶的照片,其显示了芽孢杆菌菌株8992、芽孢杆菌菌株2112、芽孢杆菌菌株4954和芽孢杆菌菌株2310的RAPD PCR图谱(引物2和3)。

  示例性实施方案的详细描述

  申请人已经开发了芽孢杆菌菌株及其组合,它们可用于废物处理、废物降解(包括含塑料的废物)和控制废物的有害影响,例如通过除去污染物。这些菌株可以增加塑料废物(例如高密度聚乙烯)的腐败速率,降解市政固体废物,增强废物稳定性,减少废物中的污染物,减少化学需氧量,减少废物中的有机物(例如,烃),减少废物中的气味(例如,硫化氢和硫酸盐)等。更具体地,本发明涉及分离的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株,和具有这些菌株的所有鉴定特征的菌株,和它们的组合,用于包括上述用途的用途。芽孢杆菌菌株2112是枯草芽孢杆菌菌株且菌株8992、4954和2310是解淀粉芽孢杆菌菌株。

  在一个实施方案中,提供了一种处理废物以除去污染物的方法,该方法包括使所述废物与有效量的分离的芽孢杆菌菌株接触和除去所述污染物,所述菌株选自:芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No.B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  在另一个实施方案中,提供了一种控制废物的有害影响的方法。该方法包括使所述废物与有效量的分离的芽孢杆菌菌株接触和控制所述废物的有害影响,所述菌株选自:芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112(NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310(NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  在各种其它实施方案中,提供了商业包装、废物添加剂和组合物。商业包装、废物添加剂和组合物包含分离的选自以下的芽孢杆菌菌株:芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No.B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  以下条款及其组合提供了本文描述的本发明的各种另外的示例性方面。在标题为“示例性实施方案的详细描述”的这部分中描述的各种实施方案适用于在以下编号的条款中描述的本发明的以下实施方案中的任一个。

  1. 一种处理废物以除去污染物的方法,所述方法包括使所述废物与有效量的分离的芽孢杆菌菌株接触和除去所述污染物,所述菌株选自:芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No.B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No.B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  2. 条款1的方法,其中所述废物选自:工业废物、市政固体废物、垃圾填埋场废物、土壤废物、废水、堆肥废物、受污染的地下水、来自废物的渗滤液、含聚合物的废物、含烃废物、含塑料的废物、含聚乙烯的废物、含高密度聚乙烯的废物和含塑料袋的废物。

  3. 条款1或2的方法,其中所述污染物是塑料。

  4. 条款1-3中的任一个的方法,其中所述污染物是聚乙烯。

  5. 条款4的方法,其中所述污染物是高密度聚乙烯。

  6. 条款1-5中的任一个的方法,其中所述污染物是有机化合物。

  7. 条款6的方法,其中所述有机化合物通过降解除去。

  8. 条款1-2中的任一个的方法,其中所述污染物是无机化合物。

  9. 条款1-8中的任一个的方法,其中所述芽孢杆菌菌株中的至少一种具有抗微生物活性。

  10. 条款9的方法,其中所述抗微生物活性是针对选自以下的细菌:大肠杆菌(E. coli)、沙门氏菌(Salmonella)、葡萄球菌(Staphylococcus)、肠球菌(Enterococcus)、梭状芽胞杆菌(Clostridia)、弯曲杆菌(Campylobacter)和它们的组合。

  11. 条款1-10中的任一个的方法,其中所述芽孢杆菌菌株产生选自以下的酶:水解酶、氧化还原酶、半乳糖苷酶、NSPase、植酸酶、阿拉伯木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、酯酶、脂肪酶和它们的组合。

  12. 条款11的方法,其中所述酶是酯酶。

  13. 条款11的方法,其中所述酶是脂肪酶。

  14. 条款1-13中的任一个的方法,进一步包括用另一种细菌菌株处理废物,所述另一种细菌菌株选自:另一种芽孢杆菌菌株、乳酸细菌菌株和它们的组合。

  15. 条款1-14中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No.B-67472)或具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株。

  16. 条款1-14中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No.B-67473)或具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株。

  17. 条款1-14中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No.B-67471)或具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株。

  18. 条款1-14中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No.B-67474)或具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株。

  19. 条款1-14中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No.B-67472)。

  20. 条款1-14中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No.B-67473)。

  21. 条款1-14中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No.B-67471)。

  22. 条款1-21中的任一个的方法,其中所述芽孢杆菌菌株的有效量是约1.0 x102 CFU/克废物至约1.0 x 106 CFU/克废物。

  23. 条款1-21中的任一个的方法,其中所述芽孢杆菌菌株的有效量是约1.0 x102 CFU/克废物至约1.0 x 104 CFU/克废物。

  24. 条款1-21中的任一个的方法,其中所述有效量是大于约1.0 x 102 CFU/克废物至约1.0 x 103 CFU/克废物的量。

  25. 条款1-24中的任一个的方法,进一步包含使所述废物与选自以下的酶接触:水解酶、氧化还原酶、半乳糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、酯酶、淀粉酶、半纤维素酶、阿拉伯木聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶、NSPase、植酸酶和它们的组合。

  26. 一种控制废物的有害影响的方法,所述方法包括使所述废物与有效量的分离的芽孢杆菌菌株接触和控制所述废物的有害影响,所述菌株选自:芽孢杆菌菌株8992(NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  27. 条款26的方法,其中所述废物选自:工业废物、市政固体废物、垃圾填埋场废物、土壤废物、废水、堆肥废物、受污染的地下水、来自废物的渗滤液、含聚合物的废物、含烃废物、含塑料的废物、含聚乙烯的废物、含高密度聚乙烯的废物和含塑料袋的废物。

  28. 条款26或27的方法,其中所述有害影响由塑料造成。

  29. 条款26-28中的任一个的方法,其中所述有害影响由聚乙烯造成。

  30. 条款29的方法,其中所述有害影响由高密度聚乙烯造成。

  31. 条款26-30中的任一个的方法,其中所述有害影响由有机化合物造成。

  32. 条款31的方法,其中所述有机化合物通过降解除去。

  33. 条款26-27中的任一个的方法,其中所述有害影响由无机化合物造成。

  34. 条款26-33中的任一个的方法,其中所述芽孢杆菌菌株中的至少一种具有抗微生物活性。

  35. 条款34的方法,其中所述抗微生物活性是针对选自以下的细菌:大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、肠球菌、梭状芽胞杆菌、弯曲杆菌和它们的组合。

  36. 条款26-35中的任一个的方法,其中所述芽孢杆菌菌株产生选自以下的酶:水解酶、氧化还原酶、半乳糖苷酶、NSPase、植酸酶、阿拉伯木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、酯酶、脂肪酶和它们的组合。

  37. 条款36的方法,其中所述酶是酯酶。

  38. 条款36的方法,其中所述酶是脂肪酶。

  39. 条款26-38中的任一个的方法,进一步包括用另一种细菌菌株处理废物,所述另一种细菌菌株选自:另一种芽孢杆菌菌株、乳酸细菌菌株和它们的组合。

  40. 条款26-39中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株8992 (NRRLNo. B-67472)或具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株。

  41. 条款26-39中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株2112 (NRRLNo. B-67473)或具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株。

  42. 条款26-39中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株2310 (NRRLNo. B-67471)或具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株。

  43. 条款26-39中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株4954 (NRRLNo. B-67474)或具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株。

  44. 条款26-39中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株8992 (NRRLNo. B-67472)。

  45. 条款26-39中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株2112 (NRRLNo. B-67473)。

  46. 条款26-39中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株2310 (NRRLNo. B-67471)。

  47. 条款26-39中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株4954 (NRRLNo. B-67474)。

  48. 条款26-47中的任一个的方法,其中所述芽孢杆菌菌株的有效量是约1.0 x102 CFU/克废物至约1.0 x 106 CFU/克废物。

  49. 条款26-47中的任一个的方法,其中所述芽孢杆菌菌株的有效量是约1.0 x102 CFU/克废物至约1.0 x 103 CFU/克废物。

  50. 条款26-49中的任一个的方法,进一步包含使所述废物与选自以下的酶接触:水解酶、氧化还原酶、半乳糖苷酶、NSPase、植酸酶、阿拉伯木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、酯酶、脂肪酶和它们的组合。

  51. 一种商业包装,其包含分离的选自以下的芽孢杆菌菌株:芽孢杆菌菌株8992(NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  52. 一种废物添加剂,其包含分离的选自以下的芽孢杆菌菌株:芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  53. 一种组合物,其包含分离的选自以下的芽孢杆菌菌株:芽孢杆菌菌株8992(NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  54. 条款51-53中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株造成废物中有机化合物的降解或无机化合物的除去。

  55. 条款51-54中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株呈浓缩物的形式。

  56. 条款51-54中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株呈超浓缩物的形式。

  57. 条款51-56中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株呈干燥形式。

  58. 条款51-57中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株呈丸粒形式。

  59. 条款51-56中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述菌株呈选自粉末、液体和丸粒形式的形式。

  60. 条款51-59中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,进一步包含用于所述芽孢杆菌菌株的载体。

  61. 条款60的商业包装、添加剂或组合物,其中所述载体选自盐、糊精和它们的组合。

  62. 条款51-61中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其在袋中。

  63. 条款62的商业包装、添加剂或组合物,其中所述袋是塑料袋。

  64. 条款51-63中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其进一步包含所述芽孢杆菌菌株中的一种或多种的使用说明书。

  65. 条款51-64中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其在20-磅袋中。

  66. 条款51-64中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其在50-磅袋中。

  67. 条款51-57或60-66中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株呈粉末形式。

  68. 条款51-56中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株呈液体形式。

  69. 条款51-68中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株是在用于商业使用的容器中。

  70. 条款69的商业包装、添加剂或组合物,其中所述容器包括塑料。

  71. 条款69的商业包装、添加剂或组合物,其中所述容器包括纸。

  72. 条款51-71中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,进一步包含粘合剂。

  73. 条款72的商业包装、添加剂或组合物,其中所述粘合剂选自粘土、酵母细胞壁组分、硅酸铝和葡聚糖或它们的组合。

  74. 条款51-73中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株降解塑料。

  75. 条款51-74中的任一个的商业包装、添加剂或组合物,其中所述芽孢杆菌菌株降解高密度聚乙烯。

  76. 条款26-50中的任一个的方法,其中所述有害影响是气味且所述气味受到控制。

  77. 条款76的方法,其中所述气味由硫酸盐和硫化氢(H2S)产生造成。

  78. 一种包含至少四层的垃圾填埋场模拟器,所述层包括土壤层、废物和土壤层、引流层和过滤器。

  79. 条款78的垃圾填埋场模拟器,其中所述土壤层是压实的土壤。

  80. 条款78或条款79的垃圾填埋场模拟器,其中所述引流层是颗粒状的。

  81. 条款78-80中的任一个的垃圾填埋场模拟器,其中所述过滤器是土工织物过滤器。

  82. 条款78-81中的任一个的垃圾填埋场模拟器,进一步包含试验样品。

  83. 条款82的垃圾填埋场模拟器,其中所述试验样品是用于降解塑料的细菌,且其中在所述废物和土壤层中的废物包含含塑料的废物。

  84. 条款83的垃圾填埋场模拟器,其中所述塑料是聚乙烯。

  85. 条款78-84中的任一个的垃圾填埋场模拟器,其中所述土壤层是顶层,所述过滤器是底层,所述废物和土壤层以及所述引流层在所述土壤层和所述过滤器之间,所述废物和土壤层在所述土壤层和所述引流层之间,且所述引流层在所述过滤器与所述废物和土壤层之间。

  86. 条款82-85中的任一个的垃圾填埋场模拟器,用于测试试验样品是否能够降解塑料。

  87. 条款82-86中的任一个的垃圾填埋场模拟器,用于测试试验样品能够多快地降解塑料。

  88. 条款83-87中的任一个的垃圾填埋场模拟器,其中所述塑料选自聚乙烯(PE)、聚氯乙烯(PVC)、聚氨酯(PUR)、聚苯乙烯(PS)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚烯烃(PO)、环氧树脂、弹性体、热塑性物质、基于生物的塑料、可生物降解的塑料和复合塑料。

  89. 一种测试试验样品是否可以从垃圾填埋场除去污染物或控制垃圾填埋场中的废物的有害影响的方法,所述方法包括下述步骤:使所述试验样品与垃圾填埋场模拟器接触,其中所述垃圾填埋场模拟器包含至少四层,所述四层包括土壤层、废物和土壤层、引流层和过滤器。

  90. 条款89的方法,其中所述土壤层是压实的土壤。

  91. 条款89或条款90的方法,其中所述引流层是颗粒状的。

  92. 条款89-91中的任一个的方法,其中所述过滤器是土工织物过滤器。

  93. 条款89-92中的任一个的方法,其中所述试验样品是细菌菌株。

  94. 条款93的方法,其中所述方法用于测试所述试验样品是否可以降解塑料且其中在所述废物和土壤层中的废物包含含塑料的废物。

  95. 条款94的方法,其中所述塑料是聚乙烯。

  96. 条款89-95中的任一个的方法,其中所述土壤层是顶层,所述过滤器是底层,所述废物和土壤层以及所述引流层在所述土壤层和所述过滤器之间,所述废物和土壤层在所述土壤层和引流层之间,且所述引流层在所述过滤器与所述废物和土壤层之间。

  97. 条款89-96中的任一个的方法,用于测试试验样品能够多快地降解塑料。

  98. 条款94-97中的任一个的方法,其中所述塑料选自聚乙烯(PE)、聚氯乙烯(PVC)、聚氨酯(PUR)、聚苯乙烯(PS)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚烯烃(PO)、环氧树脂、弹性体、热塑性物质、基于生物的塑料、可生物降解的塑料和复合塑料。

  99. 条款89-93中的任一个的方法,用于测试试验样品是否能够减少垃圾填埋场中的气味。

  100. 条款99的方法,其中所述气味由H2S造成。

  101. 条款1-14或22-25中的任一个的方法,其中所述菌株是芽孢杆菌菌株4954(NRRL No. B-67474)。

  102. 条款89的方法,其中所述废物是市政固体废物混合物。

  103. 条款89的方法,其中所述土壤层包含合成的渗滤液。

  104. 条款11或36的方法,其中所述酶是淀粉酶。

  105. 条款11或36的方法,其中所述酶是木聚糖酶。

  106. 条款11或36的方法,其中所述酶是纤维素酶。

  107. 条款11或36的方法,其中所述酶是蛋白酶。

  108. 条款1、2、9-25、26-27、34-50、101或104-107中的任一个的方法,其中所述废物是来自垃圾填埋场的渗滤液,且所述芽孢杆菌菌株可以作为繁殖物加入所述来自垃圾填埋场的渗滤液以当将所述渗滤液应用回垃圾填埋场时增加至所述垃圾填埋场的剂量率。

  109. 条款1、2、3-5、9-25、26-30、34-50、101或104-107中的任一个的方法,其中将所述芽孢杆菌菌株的孢子注入塑料中。

  110. 条款11或36的方法,其中所述酶是氧化还原酶。

  111. 条款11或36的方法,其中所述酶是半乳糖苷酶。

  112. 条款11或36的方法,其中所述酶是NSPase。

  113. 条款11或36的方法,其中所述酶是植酸酶。

  114. 条款11或36的方法,其中所述酶是阿拉伯木聚糖酶。

  115. 条款11或36的方法,其中所述酶是半纤维素酶。

  116. 条款11或36的方法,其中所述酶是水解酶。

  在不同的实施方案中,用于根据本文描述的方法、商业包装、废物添加剂和组合物的用途的芽孢杆菌菌株(例如,芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)或芽孢杆菌菌株2310(NRRL No. B-67471))可以选自:芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No.B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。芽孢杆菌菌株8992、2112、4954和2310于2017年6月22日保藏在Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL),International Depository Authority, 1815 North University Street, Peoria,Illinois 61604-3999,并分别给出登录号NRRL No. B-67472、NRRL No. B-67473、NRRLNo. B-67474和NRRL No. B-67471。在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purposes of Patent Procedure)的规定下做出所述保藏。NRRL菌株命名为MDG-8992、MDG-2112、MDG-4954和MDG-2310,它们分别等同于在本申请中提及的芽孢杆菌菌株8992、2112、4954和2310。

  这些菌株中的任一种可以单独地或组合地以本文中所述的废物添加剂或组合物的形式(例如,进一步包含载体和/或粘合剂的添加剂或组合物)用于处理废物。在一个实施方案中,多种菌株用于在单一组合物中组合地处理废物。在另一个实施方案中,多种菌株用于在单独的组合物中组合地处理废物。

  本文中使用的“具有芽孢杆菌菌株8992、2112、4954或2310的所有鉴定特征的菌株”可以是具有芽孢杆菌菌株8992、2112、4954或2310的所有鉴定特征(例如,与芽孢杆菌菌株8992、2112、4954或2310的DNA指纹对应的基于DNA分析的DNA指纹,与芽孢杆菌菌株8992、2112、4954或2310对应的酶活性,与芽孢杆菌菌株8992、2112、4954或2310对应的抗微生物活性,与芽孢杆菌菌株8992、2112、4954或2310对应的抗生素敏感性和耐受性谱,或它们的组合)的突变株。在替代实施方案中,所述突变可以是天然的突变或遗传工程改造的突变。在另一个实施方案中,“具有芽孢杆菌菌株8992、2112、4954或2310的所有鉴定特征的菌株”可以是如下产生的菌株,例如,从芽孢杆菌菌株8992、2112、4954或2310分离一个或多个质粒,并将所述一个或多个质粒引入另一种细菌,诸如另一种芽孢杆菌菌株,只要所述一个或多个质粒含有提供芽孢杆菌菌株8992、2112、4954或2310的鉴定特征(例如,与芽孢杆菌菌株8992、2112、4954或2310的DNA指纹对应的基于DNA分析的DNA指纹)的DNA。

  在另一个实施方案中,在以上段落中描述的芽孢杆菌菌株中的一种或多种(例如,芽孢杆菌菌株8992、2112、4954或2310)可以用于与另一种细菌菌株一起处理废物,所述另一种细菌菌株选自:另一种芽孢杆菌菌株、乳酸细菌菌株和它们的组合。在另一个实施方案中,所述另外的芽孢杆菌菌株可以选自:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、摩加夫芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、其它芽孢杆菌菌株和它们的组合。在另一个实施方案中,在以上段落中描述的芽孢杆菌菌株中的一种或多种(例如,芽孢杆菌菌株8992、2112、4954或2310)可以用于与任意其它细菌菌株一起处理废物,所述其它细菌菌株有效地处理废物以除去污染物或控制废物的有害影响。

  本文描述的废物添加剂或组合物可以用于处理废物任何时间段,其有效地除去污染物和/或控制废物的有害影响。例如,在一个实施方案中,废物的处理可以每天进行。废物处理的时间段是非限制性的,且应当理解,可以使用经确定有效地除去污染物和/或控制废物的有害影响的任何时间段或处理计划。

  在不同的示例性实施方案中,芽孢杆菌菌株(例如,芽孢杆菌菌株8992、2112、4954和/或2310)或除了芽孢杆菌菌株8992、2112、4954和/或2310以外添加的任意其它细菌菌株可以以约1.0 x 102 CFU/克废物、约1.0 x 102 CFU/克废物至约1.0 x 103 CFU/克废物、约1.0 x 102 CFU/克废物至约1.0 x 104 CFU/克废物、约1.0 x 102 CFU/克废物至约1.0 x105 CFU/克废物、约1.0 x 102 CFU/克废物至约1.0 x 106 CFU/克废物、约1.0 x 103 CFU/克废物至约5.0 x 1012 CFU/克废物或约1.0 x 103 CFU/克废物至约1.0 x 1010 CFU/克废物加入废物中。在其它实施方案中,所述芽孢杆菌菌株(例如,芽孢杆菌菌株8992、2112、4954和/或2310)可以以大于约1.0 x 102 CFU/克废物、大于约1.0 x 103 CFU/克废物、大于约1.1 x 103 CFU/克废物、大于约1.25 x 103 CFU/克废物、大于约1.5 x 103 CFU/克废物、大于约1.75 x 103 CFU/克废物、大于约1.0 x 104 CFU/克废物、大于约2.0 x 104 CFU/克废物、大于约3.0 x 104 CFU/克废物、大于约4.0 x 104 CFU/克废物、大于约5.0 x 104CFU/克废物、大于约6.0 x 104 CFU/克废物、大于约7.0 x 104 CFU/克废物、大于约8.0 x104 CFU/克废物、大于约1.0 x 105 CFU/克废物、大于约1.0 x 106 CFU/克废物、大于约1.0x 107 CFU/克废物、大于约1.0 x 108 CFU/克废物、大于约1.0 x 109 CFU/克废物、大于约1.0 x 1010 CFU/克废物、大于约1.0 x 1011 CFU/克废物或大于约1.0 x 1012 CFU/克废物的量加入废物中。

  在不同的实施方案中,本文描述的废物可以选自:工业废物、市政固体废物、垃圾填埋场废物、土壤废物、废水、堆肥废物、受污染的地下水、来自废物的渗滤液、含聚合物的废物、含烃废物、含塑料的废物、含聚乙烯的废物、含高密度聚乙烯的废物和含塑料袋的废物。在另一个实施方案中,所述含塑料的废物可以是含聚乙烯的废物(例如,高密度聚乙烯),或任意其它类型的包含污染物的废物,所述污染物需要除去或具有需要控制的有害影响。在另一个实施方案中,所述含塑料的废物可以选自:聚乙烯(PE)、聚氯乙烯(PVC)、聚氨酯(PUR)、聚苯乙烯(PS)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚烯烃(PO)、环氧树脂、弹性体、热塑性物质、基于生物的塑料、可生物降解的塑料和复合塑料。

  在其中废物是来自垃圾填埋场的渗滤液的另一个实施方案中,可以将芽孢杆菌菌株作为繁殖物加入来自垃圾填埋场的渗滤液中以当将所述渗滤液应用回垃圾填埋场时增加至所述垃圾填埋场的剂量率(即,所述菌株在渗滤液中繁殖,所以应用回垃圾填埋场的剂量增加)。在另一个实施方案中,可以将来自芽孢杆菌菌株的孢子注入塑料(例如,含塑料袋的废物和含塑料的废物)中以用芽孢杆菌菌株处理所述塑料。

  本文中使用的“除去污染物”或“污染物的除去”是指完全除去污染物,减少污染物的量,灭活污染物,降解污染物或使污染物转化为灭活形式。本文中使用的“控制废物的有害影响”或类似短语意指完全除去造成有害影响的污染物,减少造成有害影响的污染物的量,灭活造成有害影响的污染物,降解造成有害影响的污染物,或使导致有害影响的污染物转化为灭活形式。“控制废物的有害影响”可以意味着降解废物、增强废物稳定性、减少废物中的污染物、减少COD、减少废物中的有机物(例如,烃)、减少废物中的气味(例如,H2S和硫酸盐)等。

  在不同的示例性方面,可以从废物中除去的污染物可以选自有害微生物、有机化合物、无机化合物、含塑料的化合物、含聚乙烯的化合物、含高密度聚乙烯的化合物,和它们的组合等。在本文所述的某些实施方案中,所述芽孢杆菌菌株中的至少一种可以具有抗微生物活性。这样的抗微生物活性可以针对例如大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、肠球菌、梭状芽胞杆菌、弯曲杆菌和它们的组合。

  在其中污染物是有机化合物的实施方案中,可以通过降解除去所述有机化合物。在该实施方案中,所述有机化合物可以是,例如,含塑料的化合物、含聚乙烯的化合物、含高密度聚乙烯的化合物和它们的组合等,或者是废物中的污染物或是废物的有害影响的原因的任意其它有机化合物的副产物。在其中污染物是有机化合物的实施方案中,所述有机化合物可以来自,例如,杂货袋,或是含塑料的废物的任意其它废物,包括含聚乙烯的废物或含高密度聚乙烯的废物。

  在不同的示例性方面,本文描述的芽孢杆菌菌株(即,芽孢杆菌菌株8992、2112、4954和/或2310)产生选自以下的酶:水解酶、氧化还原酶、半乳糖苷酶、NSPase、植酸酶、阿拉伯木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、酯酶、脂肪酶和它们的组合。

  在一个示例性实施方案中,可以将一种或多种酶加入本文描述的废物添加剂或组合物中,或可以直接加入与本文描述的芽孢杆菌菌株组合的废物中。在不同的实施方案中,除了芽孢杆菌菌株以外可以用于处理废物的酶包括水解酶、氧化还原酶、半乳糖苷酶、NSPase、植酸酶、阿拉伯木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、酯酶、脂肪酶和它们的组合,和适合用于处理废物以除去污染物或控制废物的有害影响的任意其它酶。可以将上述适合用于废物处理的任何酶作为本文所述的商业包装、废物添加剂或组合物的组分添加,或可以作为单独的组合物直接加入废物。

  在本发明的另外实施方案中,提供了包含芽孢杆菌菌株8992、2112、4954和/或2310的组合物。在一个实施方案中,提供了一种商业包装,其包含分离的选自以下的芽孢杆菌菌株:芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  在另一个实施方案中,提供了一种废物添加剂,其包含分离的选自以下的芽孢杆菌菌株:芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  在另一个实施方案中,提供了一种组合物,其包含分离的选自以下的芽孢杆菌菌株:芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)、具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株和它们的组合。

  在这些实施方案中,所述芽孢杆菌菌株可以呈例如粉末、液体或丸粒的形式,且可以使用本领域已知的任意合适方法与废物混合以达到以下菌株的任何量:芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)或具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株,和它们的组合,用于废物处理以除去污染物或控制废物的有害影响。

  在本文描述的任何组合物实施方案中,芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112(NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)或具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株,和它们的组合,可以抑制选自以下的病原体:大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、肠球菌、梭状芽胞杆菌、弯曲杆菌和它们的组合。这些类型的微生物是所述芽孢杆菌菌株可以抑制的微生物类型的非限制性例子。

  在这些实施方案中,芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)或具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No.B-67471)的所有鉴定特征的菌株,和它们的组合,可以造成废物中有机化合物的降解或除去或无机化合物的除去。

  在示例性方面,芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992(NRRL No. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954(NRRL No. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)或具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株,和它们的组合,可以呈商业包装、废物添加剂或任何合适组合物的形式。在另一个示例性实施方案中,在商业包装、废物添加剂或组合物中的芽孢杆菌菌株可以呈浓缩物(例如,约1 x 108至约5 x 109 CFU/g)或超浓缩物(例如,约1 x 1010至约5 x 1012 CFU/g)的形式。在另一个实施方案中,在商业包装、废物添加剂或组合物中的芽孢杆菌菌株可以呈干燥形式(例如,粉末)、丸粒形式、液体形式、冷冻干燥形式、或凝胶形式或任意其它适合的形式。

  在另一个示例性实施方案中,在商业包装、废物添加剂或组合物中的芽孢杆菌菌株可以进一步包含用于所述芽孢杆菌菌株的载体。在不同的实施方案中,所述载体可以选自:盐、矿物油、糊精(例如,麦芽糊精)、乳清、糖、石灰石、干燥淀粉、硅铝酸钠和它们的组合。在另一个实施方案中,所述载体可以是本领域已知的用于处理废物的组合物的任意合适的载体。在另一个实施方案中,在商业包装、废物添加剂或组合物中的芽孢杆菌菌株可以进一步包含粘合剂诸如粘土、酵母细胞壁组分、硅酸铝、葡聚糖或其它已知的粘合剂和/或微量营养物,包括但不限于氮和磷。

  在其它实施方案中,包含以下菌株的商业包装、废物添加剂或组合物在用于商业使用的容器中:芽孢杆菌菌株8992 (NRRL No. B-67472)、具有芽孢杆菌菌株8992 (NRRLNo. B-67472)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)、具有芽孢杆菌菌株2112 (NRRL No. B-67473)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株4954 (NRRLNo. B-67474)、具有芽孢杆菌菌株4954 (NRRL No. B-67474)的所有鉴定特征的菌株、芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)或具有芽孢杆菌菌株2310 (NRRL No. B-67471)的所有鉴定特征的菌株,和它们的组合。在不同的实施方案中,所述容器可以是,例如,袋(例如,20-磅袋、50-磅袋、2-盎司袋、1-磅袋或1-千克袋)、药袋、卷筒、瓶子或盒子。在示例性方面,包含芽孢杆菌菌株的容器可以包含塑料、金属、箔、纸、纤维或卡纸板(例如,塑料桶、纸袋、箔袋、纤维卷筒等)。所述商业包装可以进一步包含所述芽孢杆菌菌株中的一种或多种的使用说明书。

  在其它示例性实施方案中,条款或权利要求78-88的垃圾填埋场模拟器或条款或权利要求89-100的使用垃圾填埋场模拟器的方法可以用于测试试验样品是否可以从垃圾填埋场除去污染物或控制垃圾填埋场中的废物的有害影响,所述方法包括下述步骤:使所述试验样品与垃圾填埋场模拟器接触,其中所述垃圾填埋场模拟器包含至少四层,所述四层包括土壤层、废物和土壤层、引流层和过滤器。在图3中显示了一种示例性垃圾填埋场模拟器的简图。

  下述实施例仅用于例证目的。所述实施例是非限制性的,并且无意以任何方式限制本发明。

  实施例1

  在基本培养基制品中的HDPE

  在含有预称重的高密度聚乙烯(HDPE)作为唯一碳源的基本培养基中进行了2次实验室规模测试。一式四份地制作3种制品:仅含有基本培养基、微量营养物和HDPE的对照;包括基本培养基、MDG-8992、MDG-2112、微量营养物和HDPE的处理-1 (类似于优先权文件中的COMBO-1);和包括基本培养基、MDG-4954、MDG-2310、微量营养物和HDPE的处理-2 (类似于优先权文件中的COMBO-2)。在两个月内每周进行接种和培养基更换(pH=7.0,在30℃),从而增加HDPE的腐败速率。

  温育后,将HDPE条浸入2%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液,并用去离子水洗涤以除去生物膜和污染物。将HDPE膜在55℃干燥72小时,并使用Mettler Toledo分析天平(型号XS104;得自Mettler Toledo)称重。计算初始基本培养基实验的结果,排除和包括离群值(n=4)。通过使用单向方差分析(ANOVA)和扫描电子显微术(SEM)测量表现出处理的统计显著性的HDPE膜的干重减少,分析HDPE的微生物降解。还通过测量HDPE膜的干重减少和单因素方差分析以确定显著性,评估了包括离群值的组合的初始实验和重复实验(n=8)的结果。

  实施例2

  来自基本培养基制品中的HDPE实验的结果和分析

  以下计算用于计算HDPE样品的干重减少:质量损失百分比= [(初始重量减去最终重量)/初始重量] x 100。分析有无离群值的结果。使用Iglewicz和Hoaglin离群值检验(1993), “Volume 16: How to Detect and Handle Outliers”, The ASQC BasicReferences in Quality Control: Statistical Techniques, Edward F. Mykytka,Ph.D., 编著,确定离群值。排除离群值的初始基本培养基实验(n=4)的结果表明对照、处理-1和处理-2的降解分别为0.09%±0.05、0.52%±0.19和0.43%±0.04 (图5)。假设简单的线性降解速率,对照、处理-1和处理-2制品的HDPE材料完全降解的预计时间分别为171年、30年和36年(表1)。

  表1. 在恒定速率下完全降解的预计时间

  

  使用单因素方差分析计算处理对初始和最终HDPE重量之间的差异的统计显著性。当p值低于0.05时,一种或多种处理是明显不同的。不包括离群值的HDPE的降解百分比的单因素方差分析具有在p=0.0091的p-值和在f=9.9180的f-统计值。包括离群值的初始重量和最终重量之间的毫克差异的单因素方差分析具有p=0.004。使用初始重量作为协变量在初始重量和最终重量之间的毫克差异的对一般线性模型(GLM)拟合的单因素方差分析具有p=0.006。

  获得未经处理的HDPE参照样品(图1A)和试验样品(图1B)的扫描电子显微术图像。将试验样品在基本培养基中温育两个月(pH=7.0,在30℃),其中每周接种和培养基更换与处理-2制品相同。SEM成像表明参照和试验样品具有相似的粗糙表面,具有许多小的亮颗粒和稍微纤维形态。参照样品的SEM图像未显示可见的囊泡或空化。试验样品的SEM图像显示HDPE材料的表面形态的可见变化(当与参照样品相比时),并且空化增加,这可能是由于微生物消耗或钻入HDPE膜。

  使用单向方差分析(ANOVA)评估组合的初始和重复实验(n = 8)的结果(包括离群值),以确定处理对初始和最终HDPE重量(按毫克计)之间的差异的统计显著性。图6A显示了初始和最终HDPE重量之间的差异,表明对照、处理-1和处理-2分别在0.21mg±0.11、0.60mg±0.43和0.56mg±0.35的降解(p=0.047)。当使用对一般线性模型拟合的ANOVA以用初始重量作为协变量对比最终重量与样品处理时,p-值更强。图6B显示了对照、处理-1和处理-2分别在0.19%±0.09、0.41%±0.17和0.41%±0.15的降解(p=0.014;对照相对于处理-1,p=0.016;对照相对于处理-2,p=0.008)。

  实施例3

  在垃圾填埋场模拟器模型制品中的HDPE腐败

  构建了一个中试规模垃圾填埋场模拟器以研究微生物和营养修改对HDPE的降解作用。使用六个圆筒构建该模拟器,所述圆筒装有被园林用编织物隔开的砂质棕色壤土和颗粒层(图3)。将产生的渗滤液收集在蓄池中,并每周使用Hach TNT plus化学分析化学需氧量(COD)和硫酸盐的变化。在化学分析之后,对渗滤液进行修改,并将其再循环用于所有样品。

  一式两份地制备3种制品:仅含有基本培养基、微量营养物和HDPE的对照;包括基本培养基、MDG-8992、MDG-2112、微量营养物和HDPE的处理-1;和包括基本培养基、MDG-4954、MDG-2310、微量营养物和HDPE的处理-2。预称重的HDPE膜样品被市政固体废物的专有混合物包围,然后将其悬浮并压缩在土壤填充的圆筒的下三分之一中。将水分水平调节至田间持水量,并将合成的渗滤液的专有混合物加入至最初的水分修改。将圆筒在18-34℃之间的室温下温育两个月(pH=7.35±0.3)。每天对产生的渗滤液(200mL)进行再循环,并每周进行修改。在渗滤液修改之前和之后记录温度和pH。修改包括水(调至200mL)、pH缓冲液、微量营养物的专有混合物以及处理过的制品的接种。

  为了除去生物膜和清洁,将HDPE膜样品浸入2%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中,用自来水洗涤,然后用70%乙醇和去离子水二者冲洗。将膜在55℃干燥72小时,并在分析天平上称重。通过测量HDPE膜的干重减少、使用扫描电子显微术(SEM)进行成像以及使用扫描白光干涉显微术(SWLIM)的表面轮廓表征,分析HDPE的微生物降解。

  实施例4

  来自垃圾填埋场模拟器模型制品的结果和分析

  以下计算用于计算HDPE样品的干重减少:质量损失百分比= [(初始重量减去最终重量)/初始重量] x 100。图7A显示了在垃圾填埋场模拟器中温育的样品(n = 2)的初始重量和最终重量(mg)之间的平均差异,表明1.5mg、2.15mg和1.70mg的重量下降。对于对照、处理-1和处理-2,HDPE膜的降解百分比分别为0.75%、1.07%和1.06%(图7B)。处理过的样品的降解速率提高了30%。

  在垃圾填埋场模拟器中温育后,为对照和处理-2样品(两个中的一个副本)拍摄来自垃圾填埋场模拟器实验的HDPE膜的扫描电子显微术图像。与试验样品(图2B)相比,对照样品(图2A)显示出减少的空化,这可能是由于微生物消耗或钻入HDPE膜。由于非无菌环境,对照中的HDPE表现出一些可见的囊泡和空化。使用SWLIM进行表面轮廓表征的结果表明与对照相比在试验样品中增加的粗糙度、更高的峰和更低的平均谷深度(表2)。

  

  表2. 来自使用扫描白光干涉显微术(SWLIM)的表面轮廓表征的结果表明与对照相比在试验样品中增加的粗糙度、更高的峰和更低的平均谷深度。

  表3包括假设每个样品制品在模拟垃圾填埋场环境中以简单线性速率完全降解的预计时间。数据表明,在模拟垃圾填埋场环境中,对照、处理-1和处理-2的HDPE的完全降解分别需要21年、14年和15年。当将平均处理结果与垃圾填埋场模拟器的对照进行对比时,处理过的样品存在6年差异降解速率。如果中试试验结果可以扩大到现场试验,则进入废物的生物强化可以使塑料减少30%。

  表3. 在恒定速率下完全降解的预计时间

  

  表4呈现了如果对于所有样品制品(对照、处理-1和处理-2),为在基本培养基(包括排除离群值的初步实验和包括离群值的组合实验)和模拟垃圾填埋场环境中温育的样品假设简单线性降解速率,按年计的平均HDPE降解的对比。与在基本培养基中温育相比,来自在垃圾填埋场模拟器中温育的结果显示出更高的降解速率,尽管含水量(在田间持水量上大约12%)、氧、剂量、营养物和温度下降,这可能归因于在模拟器中的天然微生物群落以及来自市政固体废物的额外营养物。

  

  表4. 对比降解所需年数的结果,为在基本培养基中的初步实验(排除离群值)、在基本培养基中的组合重复实验(包括离群值)和来自在模拟垃圾填埋场环境中温育的结果假定简单线性速率。

  生物和营养渗滤液修改降低了所有样品的COD,其中与对照相比,处理后的制品的减少增加(n = 2)。对照、处理-1和处理-2的COD分别降低了27%、38%和41%(在图8中从第2-8周的减少)。对于所有样品,硫酸盐降低到可检测水平以下,对照、处理-1和处理-2的最小值分别为83%、77%和81%(在图9中从第3-8周的减少)。

  除了塑料的减少外,渗滤液的生物处理、营养物修改和再循环具有改善渗滤液质量的潜力。当COD和渗滤液毒性降低时,天然微生物聚生体的营养物利用率增加,这促进潜在有害化学物质的吸收和代谢,从而阻止表面和地下水污染。另外,处理过的渗滤液的再循环(在生物反应器垃圾填埋场中常见)可以在剂量率中作为繁殖物。随着废物稳定性的提高和渗滤液质量的提高,可能减少三十年的封闭后护理费用并迅速回收土地。

  可以使用喷雾车将微生物接种剂和营养物施用到日常填充盖上,或直接施用到进入的废物上。替代应用包括渗滤液池和提升站台的定量以改善渗滤液质量。有必要继续进行生物强化研究以优化施用率并进一步理解降解的最终产物。

  实施例5

  在HDPE表面上的生物膜形成

  在基本培养基制品中的HDPE

  给含有高密度聚乙烯(HDPE)作为唯一碳源的基本培养基添加分离的枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌菌株以及微量营养物。用包括基本培养基、MDG-4954、MDG-2310、微量营养物和HDPE的处理-2制备了一种制品。在两个月内每周进行接种和培养基更换(pH=7.0,在30℃)。温育后,将未经清洗的HDPE样品送去进行SEM成像,以检查HDPE膜表面是否存在芽孢杆菌。从溶液取出HDPE膜,并从膜切下几小块。使所述块干燥并用金-钯薄膜溅射涂覆以促进高分辨率SEM。检查了四个单独的区域并获得了显微照片。未洗涤的HDPE膜的SEM图像显示了表面分裂和具有约1-2 μm长的棒状颗粒的定殖,后者与芽孢杆菌微生物的形态一致。这暗示通过微生物生物膜形成引发降解(图4A、图4B和图4C)。

  实施例6

  菌株鉴别和独特性

  使用随机扩增多态性DNA PCR方法(以下被称作RAPD-PCR)来鉴定每种菌株的遗传变异性。通过使用QIAGEN®组织和血液单柱试剂盒(QIAGEN®, Venlo, 荷兰),完成要用在RAPD-PCR反应中的DNA的制备。图10解释了菌株2112、8992、4954和2310的RAPD-PCR结果,其中第一泳道和最后泳道是分子量阶梯。结果表明,所有四种菌株是彼此独特的。

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