一种提升胶乳比浊法灵敏度的聚苯乙烯微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种提升胶乳比浊法灵敏度的聚苯乙烯微球及其制备方法。
背景技术
胶乳免疫比浊法(Turbidimetric inhibition immuno assay)是通过物理吸附或者共价键的方法将抗体或者抗原偶联到聚苯乙烯微球表面，形成微球-抗体(抗原)复合物。此复合物与样品中的抗原(抗体)发生抗体抗原反应，致使溶液在一定波长下的吸收值发生显著变化，通过测定反应前后吸光值变化可以计算出样品中抗原(抗体)的浓度，从而达到检测和诊断疾病的目的。作为微球诊断试剂必须满足以下三个要求：(1)微球在乳液中必须分散性好；(2)凝聚反应必须灵敏；(3)反应的特异性必须强，除了抗原抗体反应以外，不会因其他原因而发生凝聚。聚苯乙烯微球由于能够很好的满足以上条件，因此常被用于作为临床诊断的免疫微球，是常用的使抗原抗体结合的一种试剂。
但是现有技术中的聚苯乙烯微球存在以下缺陷：聚苯乙烯微球疏水性强，抗体的疏水部位会被吸附在微球表面，但是这种非特异性吸附的作用不够牢固，如放置的时间过长，微球吸附的抗体会缓慢脱落，当吸附有抗体的微球接触其他含蛋白的溶液时，吸附的抗体会和溶液中的蛋白发生交换现象而使微球失去生物活性，因此测试失去了特异性。通常，使免疫反应在微球表面上发生的主要优势是可以利用微球较大的比表面积来提高诊断的灵敏度，其中，粒径大的聚苯乙烯微球灵敏度更高。但是，粒径大的微球偶联抗体量小，线性范围也相应较窄。
发明内容
为克服现有技术缺陷，本发明期望提供一种技术方案：在不影响微球单分散性的前提下，增长微球表面羧基链的个数及长度，增加微球表面抗体(抗原)量，应用于胶乳免疫比浊法中，既提升了灵敏度，又在一定程度上可以保证线性范围。
本发明提供了以下技术方案：
本发明一方面提供了一种提升胶乳比浊法灵敏度的聚苯乙烯微球，由以下重量比原料制成，苯乙烯：疏水剂：乳化剂：聚合引发剂：光引发剂：水：烯酸的重量比为1：(0.01～0.1)：(0.01～0.05)：(0.01～0.1)：(0.05～0.15)：(0.2～0.4)：(0.1～2)；
进一步的，所述提升胶乳比浊法灵敏度的聚苯乙烯微球，由以下原料制成：苯乙烯：疏水剂：乳化剂：聚合引发剂：光引发剂：水：烯酸的重量比为1：0.05：0.025：0.05：0.1：0.3：0.3；
进一步的，所述的疏水剂为正十六烷；
进一步的，所述乳化剂为十二烷基硫酸钠或聚乙烯吡咯烷酮；
进一步的，所述聚合引发剂为过硫酸钾；
进一步的，所述光引发剂为安息香类、二苯甲酮类或硫杂蒽酮类；进一步优选的，所述光引发剂为2-异丙基硫杂蒽酮、1-羟基-环己基-苯基甲酮、安息香双甲醚或4-氯二甲苯酮；
进一步的，所述烯酸为丙烯酸。
本发明另一方面提供了一种上述提升胶乳比浊法灵敏度的聚苯乙烯微球的制备方法，包括以下步骤：
S1：按上述重量比将所述苯乙烯、疏水剂、乳化剂、聚合引发剂及光引发剂置于水中，持续通入氮气保持真空状态，在70～100℃下加热并混合搅拌2～12h，制备得到聚苯乙烯微球球核；优选的，所述加热温度为90℃；优选的，所述搅拌时间为6h；
S2：将上述制得的聚苯乙烯微球球核采用纯化水透析的方法进行纯化，然后将苯乙烯质量1％～10％的、经纯化后的聚苯乙烯微球球核置于纯化水中，在光照条件下，将其和烯酸混合反应1～5h，制备得到所述聚苯乙烯微球；优选的，所述聚苯乙烯微球球核质量为所述苯乙烯质量的5％；优选的，所述反应时间为3h。
附图说明
图1为应用实施例1～6和对比例1～2制备的聚苯乙烯微球进行C-反应蛋白测试的线性性能验证图
图2为图1的低区域值局部放大图
有益效果
本发明在不影响微球单分散性的前提下，本发明采用十分简单的制备方法增长了聚苯乙烯微球表面羧基链的个数及长度，进而增加了微球表面抗体(抗原)量，将其应用于胶乳免疫比浊法中，既提升了灵敏度，又在一定程度上可以保证线性范围，提升了检测试剂检测的线性范围。
具体实施方式
实施例1：
原料：1.0g苯乙烯、0.01g正十六烷、0.01g十二烷基磺酸钠、0.01g过硫酸钾、0.05g安息香双甲醚、0.2g水、0.1g丙烯酸；制备方法包括以下步骤：
S1：按上述重量将所述苯乙烯、疏水剂、乳化剂、聚合引发剂及光引发剂置于水中，持续通入氮气保持真空状态，在70℃下加热并混合搅拌12h，制备得到聚苯乙烯微球球核；S2：将上述制得的聚苯乙烯微球球核采用纯化水透析的方法进行纯化，然后将苯乙烯质量1％的、经纯化后的聚苯乙烯微球球核置于纯化水中，在光照条件下，将其和烯酸混合反应1h，制备得到所述聚苯乙烯微球。
实施例2：
原料：1.0g苯乙烯、0.1g正十六烷、0.05g十二烷基磺酸钠、0.1g过硫酸钾、0.15g安息香双甲醚、0.4g水、2g丙烯酸；制备方法包括以下步骤：
S1：按上述重量将所述苯乙烯、疏水剂、乳化剂、聚合引发剂及光引发剂置于水中，持续通入氮气保持真空状态，在100℃下加热并混合搅拌2h，制备得到聚苯乙烯微球球核；S2：将上述制得的聚苯乙烯微球球核采用纯化水透析的方法进行纯化，然后将苯乙烯质量10％的、所述纯化后的聚苯乙烯微球球核置于纯化水中，在光照条件下，将其和烯酸混合反应5h，制备得到所述聚苯乙烯微球。
实施例3
原料：1.0g苯乙烯、0.05g正十六烷、0.025g十二烷基磺酸钠、0.05g过硫酸钾、0.1g安息香双甲醚、0.3g水、0.3g丙烯酸；
制备方法包括以下步骤：S1：按上述重量将所述苯乙烯、疏水剂、乳化剂、聚合引发剂及光引发剂置于水中，持续通入氮气保持真空状态，在90℃下加热并混合搅拌6h，制备得到聚苯乙烯微球球核；S2：将上述制得的聚苯乙烯微球球核采用纯化水透析的方法进行纯化，然后将苯乙烯质量5％的、所述纯化后的聚苯乙烯微球球核置于纯化水中，在光照条件下，将其和烯酸混合反应3h，制备得到所述聚苯乙烯微球。
实施例4
原料：1.0g苯乙烯、0.05g正十六烷、0.025g十二烷基磺酸钠、0.05g过硫酸钾、0.1g2-异丙基硫杂蒽酮、0.3g水、0.3g丙烯酸；制备方法同实施例3。
实施例5
原料：1.0g苯乙烯、0.05g正十六烷、0.025g十二烷基磺酸钠、0.05g过硫酸钾、0.1g1-羟基-环己基-苯基甲酮、0.3g水、0.3g丙烯酸；制备方法同实施例3。
实施例6
原料：1.0g苯乙烯、0.05g正十六烷、0.025g聚乙烯吡咯烷酮-10、0.05g过硫酸钾、0.1g 4-氯二甲苯酮、0.3g水、0.3g丙烯酸；制备方法同实施例3。
对比例1
原料：1.0g苯乙烯、0.05g正十六烷、0.025g十二烷基磺酸钠、0.05g过硫酸钾、0.3g水、0.3g丙烯酸；
制备方法包括以下步骤：S1：按重量比将上述苯乙烯、疏水剂、乳化剂、聚合引发剂、烯酸置于水中，持续通入氮气保持真空状态，在90℃下加热并混合搅拌6h，制备得到聚苯乙烯微球粗品；S2：将上述制得的聚苯乙烯微球粗品用纯化水洗涤纯化后，即得。
对比例2
原料：1.0g苯乙烯、0.05g正十六烷、0.025g聚乙烯吡咯烷酮-10、0.05g过硫酸钾、0.3g水、0.3g丙烯酸；制备方法同对比例1。
实验例
1.粒径测试
分别测试实施例1～6获得的表面未连接长链羧基的聚苯乙烯球核的粒径以及实施例1～6连接了羧基以后的聚苯乙烯微球粒径、对比例1～2制备的聚苯乙烯微球粒径，记录在下表1和表2中，分别用分散度(PDI)、光强粒径分布(Intensity PSD)(单位：nm)、平均粒径(Z-AVE)(单位：nm)来全面反映各实施例和对比例的粒径，然后分别计算实施例1～6各粒径差值，记录在下表3中。
表1聚苯乙烯微球球核粒径
表2聚苯乙烯微球粒径
表3实施例1～6聚苯乙烯微球与聚苯乙烯微球球核粒径差值
由此可见，通过球核及最终聚苯乙烯微球粒径测试比较，三种光引发剂均可以在聚苯乙烯球核外外接长链羧基，且可以使得粒径增长100nm左右。
实验例2
将实施例1～6以及对比例1～2应用于C-反应蛋白免疫比浊试剂中，选择浓度为200mg/L的C-反应蛋白抗原进行一系列浓度稀释测试，分别将其稀释至原浓度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、0，然后测量其光密度(即OD值)，记录在下表4中。
表4
根据表4数据，绘制了图1和图2，图1为应用实施例1～6制备的外接多羧基链聚苯乙烯微球以及应用对比例1～2制备出的普通聚苯乙烯微球，进行C-反应蛋白测试的线性性能验证图，反映出使用了外接多羧基微球的实施例1～6，整个范围都呈现直线上升状态，高值区域的信号明显比对比例1～2要高；对比例1～2在稀释倍数在高浓度C-反应蛋白稀释至3/5以上，变化基本趋于平缓，区分度降低；而实施例1～6在此范围内仍呈现上升趋势，变化趋势和稀释至3/5以下浓度相同，进而说明实施例1-6线性明显提升；图2为图1的低区域值局部放大图，用于验证聚乙烯微球的灵敏度，对于实施例1-6，在低值区域，当浓度稀释至1/200以下，仍然有OD值，有明显的反应信号，说明该微球具有较高灵敏度；但是对比例1～2在该区域范围内OD值趋于0，无明显信号，说明该微球灵敏度较低。
综上所述，说明当应用本发明制备的外接多羧基微球制备免疫比浊试剂时，在扩大线性范围的同时，也极高地提升了灵敏度。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，均在本发明的保护范围内。
