一种滇重楼内生细菌促进滇重楼幼苗生长的方法
技术领域
本发明属于中草药栽培技术领域，具体涉及了一种滇重楼内生细菌促进滇重楼幼苗生长的方法。
背景技术
滇重楼是多年生草本植物，属百合科重楼属(Paris L.)，主要分布于云贵川一带。现代药理研究表明，主治蛇虫咬伤、跌打损伤等症，其根状茎具有消肿散瘀、凉肝定惊、清热解毒等功效，为国家基本药物，临床上应用于止血、抗肿瘤、扁桃腺炎、喉头炎、腮腺炎及上呼吸道感染等症。滇重楼是“云南白药”、“季德胜蛇药片”、“热毒清”和“宫血宁”等著名中成药的主要成分，其用历史悠久，是西部地区最具代表性的药用植物资源。
植物内生菌是植物微生态系统的天然组成部分，是指一类在植物部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物。常见的内生菌类型包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌。在内生细菌中存在着一定数量的促生细菌，这些促生细菌能够固定大气中的氮元素，溶解土壤中未溶解且含有磷和钾的化学物质，产生植物生长调节激素等供植物体生长，提供更多可利用的N、P、K及Fe等元素促进宿主植物生长。为有效利用内生细菌资源给滇重楼幼苗带来的促生作用，本发明提供一种通过接种滇重楼内生细菌从而促进滇重楼幼苗生长的方法，提高滇重楼植株生长和生物量。
此外，农民在滇重楼的种植过程中大量使用化肥和化学农药，这些化学品对环境造成一定污染，也破坏了当地的生态环境，同时滇重楼的种植及发展受到很大抑制，进而影响了滇重楼的品质。因此向滇重楼植株体内引入内生细菌，可以降低化肥和化学农药的施用，可以促进滇重楼资源的可持续利用，提升滇重楼的经济和社会效益，还同时具有明显的生态效益。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供一种滇重楼内生细菌促进滇重楼幼苗生长的方法，能够有效促进滇重楼幼苗株高、株重的增长，提高滇重楼幼苗叶绿素含量，同时减少对滇重楼培育过程中化肥和化学农药的施用量。
本发明所采用的技术方案是，一种滇重楼内生细菌促进滇重楼幼苗生长的方法，按照如下步骤：
步骤S1：内生细菌提取
步骤S1.1：将采回的滇重楼用自来水冲洗干净，选取健康的滇重楼根茎组织切成小段，并用滤纸吸干表面水分；
步骤S1.2：将滇重楼组织表面消毒，先用乙醇浸泡3min，无菌水清洗3～4次，再用次氯酸钠溶液浸泡3min，最后用无菌水清洗3～4次；
步骤S1.3：将经表面消毒的滇重楼组织放置于已灭菌的研钵中磨碎，加无菌水搅拌混匀后转移至LB液体培养基中，设置摇床温度为37℃、转速180-200rpm摇2～3h，制成菌悬液；
步骤S1.4：将菌悬液涂布于LB平板培养基上，放置于培养箱中37℃培养24～48h；
步骤S1.5：待有细菌菌落长出，用接种环刮取单菌落置于LB平板培养基上进行划线培养，经过三次划线纯化后，用接种环刮取单菌落于无菌2ml离心管中，加入1.5ml LB液体培养基，设置摇床温度为37℃、转速180-200rpm摇10-12h，制成菌液，再将菌液和灭菌甘油按1:1的体积比例混合，制成内生细菌保存液，于-80℃温度下保存。
步骤S2：盆土处理
腐殖土与红壤土按照3∶1的体积比混合，于121℃高压灭菌2h，制成灭菌营养土，移植盆用次氯酸钠溶液浸泡20min后晾干，然后每盆装冷却的灭菌营养土；
步骤S3：移栽幼苗
选取根系发达、无病害、生长正常的一年生滇重楼幼苗作为种苗，于六月下旬对苗龄为2个月的种苗进行盆栽移栽；
步骤S4：田间管理
覆盖两层六针黑色遮阴网对移栽后的滇重楼幼苗遮荫，保持大棚干净整洁和透风状态良好，注意防治病虫害，每星期除草一次，根据滇重楼幼苗生长情况适时浇无菌水；
步骤S5：灌根接种
移栽20天后，将步骤1制备的内生细菌保存液移至LB液体培养基中，设置摇床温度为37℃、转速180-200rpm摇10-12h，然后8000rpm/min离心10min，收集菌体，加入无菌水重悬至细菌浓度为2×107cfu/ml，对每盆滇重楼苗沿着苗根部附近的土壤基部浇灌50ml重悬液一次，进行灌根接种。
进一步的，所述步骤S1.2用质量浓度为75％的乙醇浸泡，用质量浓度为10.9％的次氯酸钠浸泡。
进一步的，所述步骤S1.5选取菌落颜色和形态特征差异明显的单菌落。
进一步的，所述步骤S1.5用质量浓度为50％的灭菌甘油。
进一步的，所述步骤S2用质量浓度为10％的次氯酸钠。
进一步的，所述步骤S2每盆装至土面距离移植盆盆口2-3cm。
进一步的，所述步骤S3移栽时以看不见种苗芽头再在种苗芽头覆土厚度3厘米。
本发明的有益效果是：本发明能够有效促进滇重楼幼苗株高、株重的增加，提升滇重楼的产量；同时还能提高滇重楼幼苗叶绿素含量，促进滇重楼的光合作用，提升滇重楼的品质；在滇重楼培育过程种降低了化肥和化学农药的施用量，降低了对生态环境的破坏，从而提高滇重楼整体经济效益与生态效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是G5、G20、Y2、J2四株滇重楼内生细菌功能鉴定情况。
图2是滇重楼的株高、株重增长量比较图。
图3是滇重楼的总叶绿素含量比较图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
步骤S1：内生细菌提取
步骤S1.1：将采回的滇重楼用自来水冲洗干净，选取健康的滇重楼根茎组织切成小段，并用滤纸吸干表面水分；
步骤S1.2：将滇重楼组织表面消毒，先用质量浓度为75％的乙醇浸泡3min，无菌水清洗3次，再用质量浓度为10.9％的次氯酸钠溶液浸泡3min，最后无菌水清洗3次；
步骤S1.3：将经表面消毒的滇重楼组织放置于已灭菌的研钵中磨碎，加无菌水搅拌混匀后转移至LB液体培养基中，设置摇床温度为37℃、转速180rpm摇3h，制成菌悬液；
步骤S1.4：将菌悬液涂布于LB平板培养基上，放置于37℃培养箱中培养24h；
步骤S1.5：待有细菌菌落长出，选取菌落颜色和形态特征差异明显的单菌落，用接种环刮取单菌落置于LB平板培养基上进行划线培养，经过三次划线纯化培养后，用接种环刮取单菌落于无菌2ml离心管中，加入1.5ml LB液体培养基，设置摇床温度为37℃、转速180rpm摇12h，将菌液和质量浓度为50％的灭菌甘油按1:1的体积比例混合，制成内生细菌保存液，于-80℃温度下保存；
步骤S2：盆土处理
腐殖土与红壤土按照3∶1的体积比混合，于121℃高压灭菌2h，制成灭菌营养土，移植盆用10％质量浓度的次氯酸钠溶液浸泡消毒20min后晾干，然后每盆装冷却的灭菌营养土；
步骤S3：移栽幼苗
选取根系发达、无病害、生长正常的一年生重楼幼苗作为种苗，于六月下旬对苗龄为2个月的种苗进行盆栽移栽，移栽时以看不见种苗芽头再在种苗芽头覆土厚度3厘米为宜；
步骤S4：田间管理
覆盖两层六针黑色遮阴网对移栽后的重楼幼苗遮荫，保持大棚干净整洁和透风状态良好，注意防治病虫害，每星期除草一次，根据重楼幼苗生长情况适时浇无菌水；
步骤S5：灌根接种
移栽20天后，将步骤1制备的内生细菌保存液移至LB液体培养基中，设置摇床温度为37℃、转速180rpm摇12h，然后8000rpm/min离心10min，收集菌体，加入无菌水重悬至细菌浓度为2×107cfu/ml，对每盆滇重楼苗浇灌50ml重悬液一次，内生细菌株灌根处理时沿着苗根部附近的土壤基部倒入，避免接触叶片造成烧苗。
实施例2
步骤S1：内生细菌提取
步骤S1.1：将采回的滇重楼用自来水冲洗干净，选取健康的滇重楼根茎组织切成小段，并用滤纸吸干表面水分；
步骤S1.2：将滇重楼组织表面消毒，先用质量浓度为75％的乙醇浸泡3min，无菌水清洗3次，再用质量浓度为10.9％的次氯酸钠溶液浸泡3min，最后无菌水清洗3次；
步骤S1.3：将经表面消毒的滇重楼组织放置于已灭菌的研钵中磨碎，加无菌水搅拌混匀后转移至LB液体培养基中，设置摇床温度为37℃、转速190rpm摇2.5h，制成菌悬液；
步骤S1.4：将菌悬液涂布于LB平板培养基上，放置于37℃培养箱中培养36h；
步骤S1.5：待有细菌菌落长出，选取菌落颜色和形态特征差异明显的单菌落，用接种环刮取单菌落置于LB平板培养基上进行划线培养，经过三次划线纯化培养后，用接种环刮取单菌落于无菌2ml离心管中，加入1.5ml LB液体培养基，设置摇床温度为37℃、转速190rpm摇11h，将菌液和质量浓度为50％的灭菌甘油按1:1的体积比例混合，制成内生细菌保存液，于-80℃温度下保存；
步骤S2：盆土处理
腐殖土与红壤土按照3∶1的体积比混合，于121℃高压灭菌2h，制成灭菌营养土，移植盆用质量浓度为10％的次氯酸钠溶液浸泡消毒20min后晾干，然后每盆装冷却的灭菌营养土；
步骤S3：移栽幼苗
选取根系发达、无病害、生长正常的一年生重楼幼苗作为种苗，于六月下旬对苗龄为2个月的种苗进行盆栽移栽，移栽时以看不见种苗芽头再在种苗芽头覆土厚度3厘米为宜；
步骤S4：田间管理
覆盖两层六针黑色遮阴网对移栽后的重楼幼苗遮荫，保持大棚干净整洁和透风状态良好，注意防治病虫害，每星期除草一次，根据重楼幼苗生长情况适时浇无菌水；
步骤S5：灌根接种
移栽20天后，将步骤1制备的内生细菌保存液移至LB液体培养基中，设置摇床温度为37℃、转速190rpm摇11h，然后8000rpm/min离心10min，收集菌体，加入无菌水重悬至细菌浓度为2×107cfu/ml，对每盆滇重楼苗浇灌50ml重悬液一次，内生细菌株灌根处理时沿着苗根部附近的土壤基部倒入，避免接触叶片造成烧苗。
实施例3
步骤S1：内生细菌提取
步骤S1.1：将采回的滇重楼用自来水冲洗干净，选取健康的滇重楼根茎组织切成小段，并用滤纸吸干表面水分；
步骤S1.2：将滇重楼组织表面消毒，先用质量浓度为75％的乙醇浸泡3min，无菌水清洗4次，再用质量浓度为10.9％的次氯酸钠溶液浸泡3min，最后无菌水清洗4次；
步骤S1.3：将经表面消毒的滇重楼组织放置于已灭菌的研钵中磨碎，加无菌水搅拌混匀后转移至LB液体培养基中，设置摇床温度为37℃、转速200rpm摇2h，制成菌悬液；
步骤S1.4：将菌悬液涂布于LB平板培养基上，放置于37℃培养箱中培养48h；
步骤S1.5：待有细菌菌落长出，选取菌落颜色和形态特征差异明显的单菌落，用接种环刮取单菌落置于LB平板培养基上进行划线培养，经过三次划线纯化培养后，用接种环刮取单菌落于无菌2ml离心管中，加入1.5ml LB液体培养基，设置摇床温度为37℃、转速200rpm摇10h，将菌液和50％灭菌甘油按1:1的体积比例混合，制成内生细菌保存液，于-80℃温度下保存；
步骤S2：盆土处理
腐殖土与红壤土按照3∶1的体积比混合，于121℃高压灭菌2h，制成灭菌营养土，移植盆用质量浓度为10％的次氯酸钠溶液浸泡消毒20min后晾干，然后每盆装冷却的灭菌营养土；
步骤S3：移栽幼苗
选取根系发达、无病害、生长正常的一年生重楼幼苗作为种苗，于六月下旬对苗龄为2个月的种苗进行盆栽移栽，移栽时以看不见种苗芽头再在种苗芽头覆土厚度3厘米为宜；
步骤S4：田间管理
覆盖两层六针黑色遮阴网对移栽后的重楼幼苗遮荫，保持大棚干净整洁和透风状态良好，注意防治病虫害，每星期除草一次，根据重楼幼苗生长情况适时浇无菌水；
步骤S5：灌根接种
移栽20天后，将步骤1制备的内生细菌保存液移至LB液体培养基中，设置摇床温度为37℃、转速200rpm摇10h，然后8000rpm/min离心10min，收集菌体，加入无菌水重悬至细菌浓度为2×107cfu/ml，对每盆滇重楼苗浇灌50ml重悬液一次，内生细菌株灌根处理时沿着苗根部附近的土壤基部倒入，避免接触叶片造成烧苗。
为进一步说明滇重楼内生细菌促进滇重楼幼苗生长的内部作用机理，对上述实施例1-3所提取的内生细菌进行菌株鉴别。采用CTAB法提取滇重楼内生细菌基因组DNA，对滇重楼内生细菌的种属进行鉴定。利用细菌的通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3')、1492R(5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3')对菌株进行PCR扩增。PCR反应的扩增体系具体组成如下：2.5mmol/L dNTP 4μL，5U/μL TaqDNA酶0.5μL，25mmol/L MgCl2 4μL，10×PCR缓冲液5μL，正反向引物27F/1492R 10mmol/L各2μL，ddH2O 28.5μL，DNA模板4μL，共50μL。
按下列条件在PCR扩增仪上进行PCR扩增：94℃预变性5min，94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1.5min，34个循环后72℃延伸10min。反应结束后，取1μL 6×loadingbuffer和PCR扩增产物5μL均匀混合，上样于1.5％琼脂糖凝胶，150伏电压电泳25min左右，电泳检测扩增效果。将PCR产物送昆明硕擎有限公司测序。将测序结果在GenBank进行BLAST比对，搜索同源序列，确定滇重楼内生细菌分别为G5简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)、G20无色杆菌(Alcaligenaceae bacterium)、Y2成团泛菌(Pantoea agglomerans)和J2巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)四种种属。
将四株滇重楼内生细菌分别接种于固氮、解钾、解磷平板培养基上，28℃恒温倒置培养7d，如图1所示，结果显示四株内生细菌，均具有解钾、固氮的功能，其中Y2和J2菌株具有解有机磷功能，G5具有解无机磷功能。
表1 G5、G20、Y2、J2滇重楼内生细菌的功能
注：“+”表示有此功能，“—”表示无此功能。
对实施例1中移栽后的滇重楼幼苗只浇无菌水，作为对照CK组。如图2、图3所示，单一回接四株滇重楼内生细菌后，滇重楼株高和株重和对照CK相比，单一接种四株内生细菌菌株后，滇重楼植株株高和鲜重增长量呈现不同水平的增长趋势，以J2菌株增长量最大，增高达1.13cm。株重增长以G5菌株增长量最大达0.111g。在叶绿素含量也呈现不同程度的增加，其中以J2菌株叶绿素含量最高，达2.461mg/g，接种G5、G20、Y2、J2菌株的滇重楼叶片叶绿素含量均极显著高于对照。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
