一种防治甘蔗黑穗病的生物菌肥及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种微生物菌肥及其制备方法，具体涉及一种防治甘蔗黑穗病的生物菌肥及其制备方法，属微生物肥料技术领域。
背景技术
甘蔗是一种一年生或多年生热带和亚热带草本植物，是我国重要的糖料作物和经济作物，是保证我国糖业安全的主要来源。目前，国内甘蔗种植区主要分布在广西、广东、云南、海南等地区。甘蔗黑穗病(Sugarcane smut)又名甘蔗鞭黑穗病、灰包病等。此病害于1877年在南非纳塔尔首次被报道，1940年以前，甘蔗黑穗病的主要发生地在东半球，随后在西半球也逐渐报道了该病害的发生。1932年，我国在广州报道了此病害的发生。该病现已成为甘蔗的主要病害，严重影响我国糖业的健康稳定发展。甘蔗的无性繁殖栽培技术，蔗种的跨蔗区调运，长期连作单一品种，多年的宿根蔗，是造成甘蔗黑穗病的日趋严重的主要原因，对甘蔗糖业的发展以及糖业安全造成了严重影响。近年来，由于生物防治具有环保、安全、可持续等特点，得到了广泛的应用。
甘蔗渣是制糖工业的主要副产品，但由于甘蔗渣木质化程度高，以及现有利用技术手段落后，导致其利用率很低。此外养殖场的畜禽粪便随地弃置，使大量的养分资源流失，这些不合理的使用不仅严重污染了环境，也极大地造成了浪费，制约了我国农业的可持续发展。将甘蔗渣和畜禽粪便经过高温堆积发酵制成生物菌肥再施入土壤中，可有效解决农业有机废弃物的问题，不仅能够变废为宝，实现资源再利用，而且还能够净化和完善农业生态环境。因此，将这些农业有机废弃物经过高温发酵成高品质的有机肥，再用作土壤有益微生物的载体，制备成为具有明确功能的微生物菌肥，具有广阔的应用前景。
为此，需要提供一种防治甘蔗黑穗病的生物菌肥及其制备方法，旨在解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防治甘蔗黑穗病生物菌肥及其制备方法，以解决甘蔗生产中存在的问题。
本发明的防治甘蔗黑穗病的生物菌肥的制备方法，其特征在于制备步骤如下:
(1)将甘蔗渣投入到粉碎机中进行粉碎至颗粒长度为0.5-1cm，得粉碎后的蔗渣；
(2)按重量份调配，取步骤(1)粉碎后的蔗渣50～80份、与鲜牛粪200-250份、大豆饼15-20份，碳酸钙3～5份，加水混合均匀，制得混合物A，其初始含水率为55％，PH 7.0～7.5；
(3)在步骤(2)的混合物A中加入发酵剂3-5份，搅拌均匀，堆积成堆，2天翻堆一次，直至混合物内部温度降低到30℃～40℃时，一次发酵结束，得到生物菌肥发酵基质B；
(4)对生防菌进行液体发酵培养，得到含菌量为1.0×1010cfu/ml的生防菌发酵液；所述生防菌为防治甘蔗黑穗病的解淀粉芽孢杆菌ZHRO(Bacillus amyloliquifaciens),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2014577，保藏单位地址：中国、武汉，武汉大学，保藏日期：2014年11月24日；
(5)将步骤(4)的生防菌发酵液，按体积质量比为30％接种到步骤(3)的生物菌肥发酵基质B中进行二次发酵，每天翻堆1次，使得生防菌的有效活菌数含量不低于1.0×108/g，在温度不高于50℃的条件下干燥至含水率不高于30％，获得防治甘蔗黑穗病的生物菌肥；所述体积质量比为m3/kg。
所述解淀粉芽孢杆菌ZHRO的生物学特性为革兰氏阳性菌，细胞为杆状，芽孢端生或近端生，淀粉水解阳性，过氧化氢酶阳性，明胶水解阳性，纤维素分解阳性，硝酸盐还原阳性，甲基红试验阳性，吲哚试验阴性，V-P反应阳性，发酵葡萄糖产酸产气，生长温度为30℃,pH值为7.5。
所述解淀粉芽孢杆菌ZHRO分离于甘蔗叶片中，是一种内生菌，对峙试验表明其对甘蔗黑穗病菌有较强的拮抗作用，适合作为生防菌对其进行开发利用。
所述解淀粉芽孢杆菌ZHRO的液体发酵培养，将解淀粉芽孢杆菌ZHRO接种到发酵罐中进行。液体发酵培养液的配方：豆粉40g/L、蔗糖15g/L、NaCl 10g/L，消泡剂0.1％总体积为25L，按配比添加到50L发酵罐中，PH值调至7.5-8.0，先空消，再实消，121～125℃灭菌30min。
所述解淀粉芽孢杆菌ZHRO的液体发酵培养，发酵罐液体发酵条件为：300r/min、溶氧30％、罐压为0.05～0.1mpa、发酵时间为60h。
本发明提供了含有解淀粉芽孢杆菌ZHRO的微生物有机肥在防治甘蔗黑穗病中的应用。
所述应用具体为在甘蔗种植过程中用作基肥(沟施)或者作为追肥使用，用量100kg-200kg/亩。
本发明的优点：
1、本发明的防治甘蔗黑穗病的生物菌肥，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于甘蔗的无公害生产，蔗农可以不用或减少化学农药的用量，这不仅可为蔗农节省开支，而且减少了甘蔗中的农药残留，保证了糖业安全。同时，该微生物肥料还有增产功能，可为蔗农增加收入。
2、本发明的防治甘蔗黑穗病的生物菌肥，不仅可以在温室施用，也可以在大田施用，不仅具有有机肥的调节土壤肥力的功能，而且，其中的解淀粉芽孢杆菌还可以通过多种促生及生防机制起作用，从而达到促生或防治甘蔗黑穗病的效果。
3、本发明的防治甘蔗黑穗病的生物菌肥，充分利用了禽畜粪便、甘蔗渣及大豆饼等农牧业副产品，能够实现资源的循环利用，并减少粪便对养殖环境的危害，符合循环农业的发展理念和绿色农业的发展要求。
4、本发明提供的防治甘蔗黑穗病的生物菌肥，其生防菌的有效活菌数含量不低于1.0×108cfu/g；全氮含量为21.02g/kg、全磷含量为4.38g/kg、全钾含量为3.65g/kg。
附图说明 图1为盆栽试验发病情况；
图2为大田试验发病情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。非特别指明，本发明采用的技术手段和药品为本领域常规手段和药品。
实施例1：生防菌发酵液的制备
在LB平板上对解淀粉芽孢杆菌ZHRO进行划线培养，挑取单菌落到灭菌的LB培养液(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中，210r/min、30℃震荡培养18h，制成种子液。
将解淀粉芽孢杆菌ZHRO种子液接种到发酵罐中进行液体发酵培养，获得生防菌发酵液。
其中，发酵罐中液体发酵培养液的配方：豆粉40g/L、蔗糖15g/L、NaCl 10g/L，消泡剂0.1％总体积为25L，按配比添加到50L发酵罐中，PH值调至7.5-8.0，先空消，再实消，121～125℃灭菌30min。
其中，所述发酵罐液体发酵条件为：300r/min、溶氧30％、罐压为0.05～0.1mpa、发酵时间为60h。
实施例2：原材料的腐熟
首先，将蔗渣投入到粉碎机中，粉碎至颗粒长度为0.5-1cm，得粉碎后的蔗渣。
然后，取粉碎后的蔗渣50～80kg，与鲜牛粪200-250kg，大豆饼15-20kg，碳酸钙3～5kg，加水混合均匀，制得混合物A，其初始含水率为55％，PH 7.0～7.5。
将混合物A中加入亨坤牌发酵剂3-5kg，搅拌均匀，堆积成堆，2天翻堆一次，利用高温杀死一些寄生虫、杂草种子和病原菌，加快腐殖质的形成。直至混合物内部温度降低到30℃～40℃时，一次发酵结束，得到生物菌肥发酵基质B。
实施例3：微生物菌肥的制备
将利用发酵罐发酵60h的生防菌发酵液，按体积质量比为30％接种到生物菌肥发酵基质B中进行二次发酵，此过程7～10天，每天翻堆1次，使得生防菌的有效活菌数含量不低于1.0×108/g，在温度不超过50℃的条件下干燥至含水率不高于30％，获得含有生防菌的微生物菌肥。本发明的防治甘蔗黑穗病的生物菌肥，其生防菌的有效活菌数含量不低于1.0×108cfu/g；全氮含量为21.02g/kg、全磷含量为4.38g/kg、全钾含量为3.65g/kg。
实施例4：温室试验
供试土壤为健康土壤，不含黑穗病的冬孢子，甘蔗品种采用新台糖22(ROC22),此品种高感黑穗病，盆栽试验场地：广西大学农学院标本园温室大棚。选择蔗芽饱满健壮，无病虫害的梢部作为种茎。将收集的甘蔗黑穗病冬孢子制成悬浮液，无菌水稀释到5×106个/ml，将蔗芽饱满健壮、无病虫害的种茎浸入黑穗病冬孢子悬浮液中30min，取出放入塑料袋内封口，经过保湿催芽24h后种植。盆栽试验发病情况，如图1所示。处理设置如下：
对照组：15kg健康土壤+200g有机肥(实施例2的生物菌肥发酵基质B)+蔗种。
试验组：15kg健康土壤+200g本发明的生物菌肥+蔗种。
采用种植前穴施的方法，每个处理10盆，每盆5株。定期灌水、除草、去分蘖，盆栽甘蔗由于根系生长环境变小，生长受到限制，如果肥料，水分跟不上，势必影响甘蔗的生长发育。因此，除了盆栽时施有机肥外，从苗期开始，每月施一次复合肥，同时，经常打去脚叶、枯叶，去除多余的分蘖及杂草，保持通风透光，确保证主茎能吸收充足的养分，快速健壮的生长。正常管理并定期调查黑穗病，计算每处理最终发病率。
发病率＝发病株数/总株数×100％。
防治率＝(对照发病率-试验发病率)/对照发病率×100％。
试验结果：
甘蔗生长4个月后，对照组中植株的发病率达到了17.5％，而添加了本发明生物菌肥的试验组其发病率仅为4.4％，防治率达到了74.86％。
表1：盆栽试验中生物菌肥对甘蔗黑穗病的生防效果
实施例5：大田试验
在广西壮族自治区扶绥县渠黎镇进行了田间试验，以200kg/亩的施用量进行试验，设置两个处理：1、对照组，施用有机肥(实施例2的生物菌肥发酵基质B)；2、试验组，施用本发明的生物菌肥，每个处理重复3次，小区面积为200m2。选择蔗芽饱满健壮，无病虫害的梢部作为种茎。将收集的甘蔗黑穗病冬孢子制成悬浮液，无菌水稀释到5×106个/ml，将蔗芽饱满健壮，无病虫害的种茎浸入黑穗病冬孢子悬浮液中30min，取出放入塑料袋内封口，经过保湿催芽24h后种植。
采用种植前沟施的方法，定期灌水、除草、去分蘖。除了种植时施有机肥外，培土前再追施一次有机肥，同时,经常打去脚叶、枯叶，去除多余的分蘖及杂草，保持通风透光,确保证主茎能吸收充足的养分，快速健壮的生长。大田试验发病情况，如图2所示。正常管理并定期调查黑穗病，计算每处理最终发病率。
发病率＝发病株数/总株数×100％。
防治率＝(对照发病率-试验发病率)/对照发病率×100％。
试验结果：
甘蔗生长7个月后，对照组中植株的发病率达到了7.22％，而添加了本发明生物有机肥的试验组其发病率仅为2.29％，防治率达到了68.28％。
表2：大田试验中生物有机肥对甘蔗黑穗病的生防效果
本发明防治甘蔗黑穗病的生物菌肥，从土壤微生物菌群结构入手，有益菌株大量定殖于甘蔗根际和体内，形成优势菌群，防治率达到65％以上，为防治甘蔗黑穗病的发生提供了一种新的方法。
