一种嗜热好望角放线菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种嗜热好望角放线菌及其应用。
背景技术
鸡粪是一种比较优质的有机肥，其含纯氮、磷(P2O5)、钾等多种元素。鸡粪在施用前必须经过腐熟，将存在鸡粪中的寄生虫及其卵以及其他一些传染性的病菌通过腐熟的过程得到灭活及脱臭。它含有植物所需的中微量元素、有益微生物活性菌及多种酶。这些微生物菌在土壤中的生命活动，能固定空气中氮素、疏松土壤、分解土壤中长期使用化肥固化的磷钾矿物质，为作物提供足够的多种营养元素。传统的生物有机肥的生产技术以厌氧堆肥为主，采用的发酵微生物大都是低温菌种，发酵温度一般控制在45℃，时间长(3-6个月)、效率低，而且低温环境下无法达到去除有害病菌、虫卵的效果，有益微生物往往不能达到国家生物有机肥标准。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明专利首先获得了一种放线菌地方株(经第三方鉴定为好望角链霉菌，命名为HWJ001)。其由熟化的生物有机肥中分离，经纯化鉴定，人工驯化适应工业化生产后，再通过耐热驯化，培育成为可用于工业化生产生物有机肥的菌种。本菌种建议分类名为：好望角链霉菌(Streptomyces speibonae)，已于2019年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为：CGMCCNo.17831。
进一步的，本发明获得的好望角链霉菌HWJ001菌株能够用于有机肥的发酵生产，特别是鸡粪有机肥的高温发酵生产。
同时，本发明设计了上述好望角链霉菌HWJ001菌株直接用于鸡粪有机肥高温发酵生产的微生物菌剂，所述微生物菌剂中所述好望角链霉菌HWJ001株的含量不少于1亿个CFU/ml。
同时，本发明设计了一种鸡粪有机肥高温发酵的方法，所述鸡粪有机肥高温发酵的原料为鸡粪、上述含有好望角链霉菌HWJ001菌种的微生物菌剂、花生壳、锯末和红糖，所述发酵方法包括以下步骤，
a、发酵菌剂制备，取含有好望角链霉菌HWJ001菌株的微生物菌剂500ml，加入到10L质量分数5％的红糖水中,置恒温摇床，37℃发酵4-6小时；
b、取5L发酵好的发酵菌剂均匀喷洒在花生壳和锯末的混合物料上，该混合物料中花生壳和锯末的质量比为1:1；
c、将步骤b的花生壳和锯末的混合物料平铺在发酵池中，厚度为50cm；
d、按鸡粪：花生壳和锯末＝1:1的体积比，将鸡粪加入到发酵池中，并用翻耙机翻耙使鸡粪与花生壳、锯末混合均匀；
e、使用水分测定仪检测步骤d的混合物的水分，调整发酵物水分含量在40％-60％；
f、发酵过程中，使用翻耙机每日上午、下午各翻耙一次，并测量记录温湿度，鸡粪在微生物菌剂的作用下，温度很快升到50～60摄氏度，在4天左右达到70℃以上，并持续1周；发酵2～3周后温度下降至50℃以下发酵结束。
相对于现有技术，本发明专利提供的嗜热好望角链霉菌HWJ001菌株能够适应70℃以上的高温，高温条件下促进了发酵物料的快速降解，将整个发酵周期缩短到3周以内，大大的提高了鸡粪有机肥的生产效率；同时肥料经过高温发酵的过程将肥料中残留的虫卵、病毒等有害生物进行了有效的消灭；并且发酵结束得到的有机肥料保留了较多有益物质，有益菌的含量达到国家标准，肥料质量提升明显。
附图说明
图1是菌株显微镜形态图
图2是菌株的革兰氏染色检图
图3是菌落在四种培养基中的培养效果图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
好望角链霉菌HWJ001株的获得
一、菌株的分离鉴定：
1、按比例配制商品化放线菌固体培养基100ml，120℃灭菌30分钟；
2、称取腐熟的鸡粪10g于三角瓶中，加入90ml生理盐水，搅拌均匀，于数显恒温水浴振荡器振摇30分钟，备用；
3、将灭菌好的培养基铺到6个平皿中，凝固后备用；
4、用接种环蘸取步骤2的样品分别在6个平皿中进行划线培养；
5、将划线的平皿倒置于36℃的培养箱中，培养72小时。
6、挑取平皿上的放线菌菌落作进一步的分离纯化。
二、菌种保藏：
1、按比例配制商品化放线菌培养基100ml，120℃灭菌30分钟；
2、取试管放入160℃干燥箱中灭菌4小时，备用；
3、将灭菌好的放线菌培养基于分装灭菌完毕的试管中制备斜面培养基；
4、用接种环蘸取第一阶段得到的纯化的放线菌菌种接种至试管的培养基斜面；
5、接种完毕后置于36℃培养箱中培养72小时；
6、之后取出，置于4℃冰箱保存，作为原始菌种。
三、耐热驯化技术：
1、按比例配制商品化放线菌液体培养基，灭菌后分装至多支经高温灭菌的试管中，5ml/支；
2、取少许第二阶段的原始菌种，接种于5支装有放线菌液体培养基的5ml试管中，并于数显恒温水浴振荡器中，60℃振摇12小时；
3、取少许于60℃振摇12小时培养的菌液，再接种于5支装有放线菌液体培养基的5ml试管，于数显恒温水浴振荡器中，62℃振摇12小时；
4、取少许于62℃振摇12小时培养的菌液，再接种于5只装有放线菌液体培养基的5ml试管，于数显恒温水浴振荡器，64℃振摇12小时；
5、重复如上操作，每次移种后，培养温度提高2℃，直至于数显恒温水浴振荡器，70℃振摇12小时；
6、在70℃环境下，连续传代培养5代，直至菌株生长速度与37℃时相同，获得嗜热的放线菌
7、将嗜热的放线菌培养物在放线菌平板培养基上划线分离，挑取典型的菌落，接种于10只装有放线菌液体培养基的5ml试管培养基，数显恒温水浴振荡器70℃振摇12小时。
8、选择生长速度较快的试管中的放线菌，接种于斜面培养基。并送第三方鉴定机构，对菌株进行测序鉴定。
9、获得嗜热菌株于4℃冰箱保存，作为嗜热放线菌的原始嗜热放线菌菌种。
四、原始放线菌菌种的鉴定
1、16rDNA测序
测序工作由青岛征信检测分析有限公司完成，参照KIeser et al.中所述方法提取嗜热放线菌的基因组DNA，用细菌16rDNA通用引物扩增嗜热放线菌的16S rDNA序列。经第三方检测机构所得序列如SEQ ID No.1所示，所测序列进行同源性比较，比较结果显示嗜热放线菌与好望角链霉菌(Streptomyces speibonae)最为相似，相似性为99.19％。命名为好望角链霉菌HWJ001株。
2、培养形态特征
如图3所示，将好望角链霉菌HWEJ001株分别于高氏1号培养基、酵母膏-麦芽膏琼脂培养基、于燕麦粉琼脂培养基培养、营养琼脂培养基进行培养，其菌落形态如表1所示。
表1
3、染色镜检
如图1、2所示，光学显微镜下菌株形态气生菌丝细长，基内菌丝较粗，孢子丝钩状，革兰氏染色阳性。
4、生化鉴定
挑取典型菌株进行深化鉴定，其具体鉴定方法及鉴定结果如表2所示
表2
综上，经16rDNA测序得到的基因序列分析，并进一步对比HWJ001株与现有好望角链霉菌的培养表型特征，可以判定HWJ001株为不同于现有好望角链霉菌的一个新菌种，该菌种建议分类名为：好望角链霉菌(Streptomyces speibonae)，于2019年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC No.17831。
四、菌种扩繁技术：
1、按比例配制商品化放线菌液体培养基10000ml，分装至数支5ml试管、数个250三角烧瓶、1000ml三角烧瓶，于120℃高压灭菌锅中灭菌30分钟；
2、取少许好望角链霉菌HWJ001株菌种，接种于盛有放线菌液体培养基的5ml试管，于数显恒温水浴振荡器37℃振摇12小时，之后于4℃冰箱保存，作为试管生产菌种。
3、取一支试管生产菌种，接种到盛有放线菌液体培养基的250ml三角烧瓶培养基中，于数显恒温水浴振荡器37℃振摇12小时，作为三角瓶菌种；
4、将三角瓶菌种按5％(V/V)接种到1000ml三角烧瓶放线菌液体培养基中，于数显恒温水浴振荡器37℃振摇12小时，4℃冰箱保存，作为发酵有机肥的微生物菌剂，微生物菌剂中好望角链霉菌HWJ001菌株超过1亿CFU/ml。
实施例2
好望角链霉菌HWJ001株在鸡粪高温发酵有机肥生产中的应用。
鸡粪高温发酵有机肥的发酵原料为鸡粪、实施例1所制得的含有好望角链霉菌HWJ001菌种的发酵有机肥的微生物菌剂、花生壳、锯末和红糖，发酵方法包括以下步骤，
a、发酵菌剂制备，取含有好望角链霉菌HWJ001菌株的微生物菌剂500ml，加入10L5％红糖水中,置恒温摇床37℃发酵6小时；
b、取5L制备好的发酵菌剂好均匀喷洒在花生壳和锯末的混合物料上，该混合物料中花生壳和锯末的质量比为1:1，发酵菌剂与混合物的用量为：发酵菌剂：花生壳+锯末＝1：1000(V/W)；
c、将步骤b的花生壳和锯末的混合物料平铺在发酵池中，厚度为50cm；
d、按鸡粪：花生壳+锯末＝1:1的体积比，将鸡粪加入到发酵池中，并用翻耙机翻耙使鸡粪与花生壳、锯末混合均匀；
e、使用水分测定仪检测步骤d的混合物的水分，加水调整发酵物水分含量在60％左右；
f、发酵过程中，使用翻耙机每日上下午各翻耙一次，并测量记录温、湿度，鸡粪在微生物作用下，温度很快升到50-60摄氏度，并在4天左右达到70℃以上，持续约1周；发酵2-3周后温度下降至50℃以下发酵结束，发酵完成后，肥料干燥松软呈黄褐色，有灰白色菌丝。
对上述步骤生产得到的鸡粪高温发酵有机肥送第三方检测机构进行检测，并与传统方法生产的鸡粪发酵有机肥进行肥效应用对比，其中使用传统有机肥的为A组，添加本专利申请的有机肥的为B组，每周末取一次样本，按照复合微生物肥料NY/T 79-2004方法计数有效活菌数。计数结果如表3所示：
表3生物有机肥有效活菌生长数量
由上表可以看出。从第一周开始，有效细菌开始生长。其中不加本专利菌组(A组)为5*10^5CFU/g，加本专利菌株组(B组)可达10*10^5CFU/g，经统计学分析两组间有显著差异。第二周，不加本专利菌组(A组)为9±0.82*10^5CFU/g，加本专利菌组(B组)可达74.33±4.19*10^5CFU/g，经统计学分析两组间有显著差异。第三周，不加本专利菌组(A组)为44.33±3.30*10^5CFU/g，加本专利菌组(B组)可达5112.33±78.79*10^5CFU/g，经统计学分析两组间有显著差异。第四周，不加本专利菌组(A组)为143±1.63*10^5CFU/g，加本专利菌组(B组)可达7468±102.15*10^5CFU/g，经统计学分析两组间有显著差异。
上述结果表明，利用本专利菌株生产发酵的有机肥，可加快发酵速度，并且最终产品中有效活菌数远远高于不加本专利菌株组。
上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。
序列表
<110> 山东中农普宁药业有限公司 山东倍倍安生物科技有限公司
<120> 一种嗜热好望角放线菌及其应用
<141> 2020-03-16
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1358
<212> DNA
<213> 好望角链霉菌(Streptomyces speibonaeHWJ001菌株16rDNA序列)
<400> 1
ggccaccggc ttcgggtgtt accgactttc gtgacgtgac gggcggtgtg tacaaggccc 60
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