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一种高黄酮含量的黄芪育苗方法

2021-02-01 10:03:31

一种高黄酮含量的黄芪育苗方法

  技术领域

  本发明涉及一种植物育苗的方法,具体涉及一种高黄酮含量的黄芪育苗方法,属于植物栽培技术领域

  背景技术

  黄芪是一种名贵中药材,是豆科植物(Leguminosae)膜荚黄芪(Astragalusmembranaeus(Fisch.)Bge)和蒙古黄芪(Astragalus%20membranaceus%20Bge.var.mongholicus(Bge.)hsiao)的干燥根。黄芪的主要药理作用有补气固表、利尿、托毒排脓、生肌等疗效,主治气短、虚脱、心悸、自汗、体虚浮肿、慢性肾炎、脱水、久泻、气虚、气血不足、中气下陷,有抗菌消炎、降压利尿、解毒利胆等功效,是一种常用中草药。国内市场对黄芪的需求极大,主要用于生产黄芪饮片以及中成药和提取物及制剂。

  近年来,由于大量的滥挖滥釆使得野生黄芪的数量急剧减少,随时都有趋于绝灭的危险。为了保护黄芪,国家将其列为三级保护植物,同时提倡大力发展种植和人工培育,适当的限制采刨和严禁采挖幼苗,保持半野生状态,在种子成熟后进行采收。

  近年来,黄芪产业化种植规模逐年扩大,但是黄芪育苗规模及技术严重滞后,还停留在传统粗放的原始育苗和种植阶段,这种落后的种植方式更多依靠天养,管理不完善,造成种植退化,药效成分不稳定,差异大,产量低;为了解决上述问题,黄芪的无土栽培技术应运而生,特别是水培育苗技术的开展使得黄芪的育苗规模扩大,成活率提高,育苗周期缩短,具有良好的应用发展前景。

  然而,在人工栽培黄芪的过程中,黄芪种子的萌芽工艺,以及水培营养液,和水培条件的开发还不完善,导致黄芪种子的萌芽率低,黄芪幼苗的成活率不稳定,生长周期长,且药效成分不稳定。

  基于上述存在的问题,调整黄芪水培过程中的萌芽工艺、营养液组成和水培条件,获得一套成熟稳定的水培方法仍然是相关企业和研究人员的研究重点,特别是开发一种种子萌芽率高、幼苗成活率高、生长周期短、药效成分稳定、黄酮含量高的黄芪水培工艺。

  发明内容

  为克服现有技术中存在的问题,本发明的目的在于提供一种高黄酮含量的黄芪育苗的方法,提高黄芪种子的萌芽率,使得幼苗生命力强,移栽成活率高,生长周期短,并且具有高的黄芪黄酮含量。

  为实现上述目的,本发明提供一种高黄酮含量的黄芪育苗的方法,包括以下步骤:

  (1)取适量黄芪种子,加入种子重量3-4倍的浓度60-75%的乙醇溶液,超声处理时间40-60s后;用水清洗3-5遍;放入冰水中浸泡2-4h后,取出放入70-90℃的水中浸泡1-2h;然后,加入种子重量2-4倍的5-8%的次氯酸钠溶液或1%的升汞溶液浸泡8-15min后,用水清洗3-5遍后沥干;

  (2)将步骤(1)中的黄芪种子放入MS培养基中进行培养,培养温度为15-25℃,湿度50-60%,培养8-12天进行萌芽,间隔2-4天更换一次MS培养基;

  所述MS培养基每升含有如下重量的组分:KNO3%204-6mM,Ca(NO3)2·4H2O%204-6mM,MgSO4·7H2O%201.5-2.5mM,KH2PO4%200.8-1.2mM,H3BO3%2044-48μM,MnCl2·4H2O%208-10μM,ZnSO4·7H2O%200.6-0.8μM,CuSO4·5H2O%200.2-0.4μM,Na2MoO4·2H2O%200.1-0.3μM,EDTA-Fe-Na%2040-60μM;

  (3)将步骤(2)中发芽的黄芪种子加入营养液中继续培养,培养温度为15-25℃,湿度50-60%,每天施加蓝光或黄光8-12h,间隔4-6天更换营养液,培养70-100天;获得高黄酮含量的黄芪幼苗;

  所述营养液每升含有如下重量的组分:

  NH4NO3%206-8mM,KNO3%206-8mM,Ca(NO3)2·4H2O%205-8mM,MgSO4·7H2O%201.5-2.5mM,KH2PO4%201-1.4mM,H3BO3%2044-48μM,MnSO4%208-10μM,ZnSO4·7H2O%200.6-0.8μM,CuCl20.3-0.5μM,Na2MoO4·2H2O%200.1-0.3μM,EDTA-Fe-Na%2040-60μM,烟酸0.3-0.6μM,三七提取物80-100mg。

  进一步,所述黄芪种子选自蒙古黄芪种子或膜荚黄芪种子,所述水为灭菌自来水;

  进一步,所述步骤(2)中MS培养基进行预先灭菌处理,所述灭菌处理为加常规加压高温处理;

  进一步,所述步骤(3)中三七提取物为三七的水、或乙醇的提取物,制备方法为取适量三七根,加入3-4倍重的水或浓度70-80%的乙醇水溶液,加热回流3-4h,过滤;将滤液冷冻干燥后制备得到三七提取物;

  进一步,所述步骤(3)中蓝光和黄光交替间隔施加,间隔周期24h。

  本发明具有以下有益效果:

  (1)具有高的萌芽率:本发明通过将黄芪种子进行高浓度乙醇浸泡和超声处理,以及变温处理,使得种皮外的致密细胞层和果胶类物质发生变性,提高通透性,在培养当天即可发芽,在8-12天时萌芽率可达97%以上;

  (2)具有高的幼苗成活率:本发明通过施加高浓度乙醇、以及5-8%的次氯酸钠溶液或1%的升汞溶液,以及选用无菌水,和对培养基进行灭菌处理,提供一种无菌的生长环境,极大了提高了幼苗的成活率,防止细菌的污染;

  (3)生长周期短:本发明通过合理调整营养液的组成和配比,特别是烟酸和三七提取物的加入使得黄芪根部生长速度加快,根系发达,能够快速达到移栽标准;

  (4)具有高的黄芪黄酮含量:本发明通过合理调整营养液的组成和配比,同时辅助以光照,能够保证黄芪幼苗的稳定和快速生长,且通过施加蓝光或黄光,特别是进一步降低蓝光和黄光交替间隔施加能够有效的促进黄酮类化合物的快速积累。

  具体实施方式

  为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

  实施例1

  一种高黄酮含量的黄芪育苗的方法,包括以下步骤:

  (1)取适量蒙古黄芪种子,加入种子重量3倍的浓度60%的乙醇溶液,超声处理时间60s后;用水清洗5遍;放入冰水中浸泡4h后,取出放入70℃的水中浸泡2h;然后,加入种子重量3倍的6%的次氯酸钠溶液浸泡15min后,用水清洗5遍后沥干;

  (2)将步骤(1)中的黄芪种子放入MS培养基中进行培养,培养温度为20℃,湿度60%,培养12天进行萌芽,间隔4天更换一次MS培养基;

  所述MS培养基每升含有如下重量的组分:KNO3%206mM,Ca(NO3)2·4H2O%206mM,MgSO4·7H2O%202.5mM,KH2PO4%201.2mM,H3BO3%2048μM,MnCl2·4H2O%2010μM,ZnSO4·7H2O0.8μM,CuSO4·5H2O%200.4μM,Na2MoO4·2H2O%200.3μM,EDTA-Fe-Na%2060μM;

  (3)将步骤(2)中发芽的黄芪种子加入营养液中继续培养,培养温度为20℃,湿度500%,每天施加蓝光12h,间隔4天更换营养液,培养80天;获得高黄酮含量的黄芪幼苗;

  所述营养液每升含有如下重量的组分:

  NH4NO3%208mM,KNO3%208mM,Ca(NO3)2·4H2O%205mM,MgSO4·7H2O%202.5mM,KH2PO41.4mM,H3BO3%2048μM,MnSO4%2010μM,ZnSO4·7H2O%200.8μM,CuCl2%200.5μM,Na2MoO4·2H2O0.3μM,EDTA-Fe-Na%2060μM,烟酸0.6μM,三七提取物100mg;

  其中,三七提取物的制备方法如下:称取10g三七根,加入40g的水加热回流3h,过滤;将滤液冷冻干燥后制备得到三七提取物。

  实施例2

  一种高黄酮含量的黄芪育苗的方法,包括以下步骤:

  (1)取适量膜荚黄芪种子,加入种子重量3倍的浓度75%的乙醇溶液,超声处理时间40s后;用水清洗5遍;放入冰水中浸泡4h后,取出放入90℃的水中浸泡1h;然后,加入4倍重的1%的升汞溶液浸泡15min后,用水清洗5遍后沥干;

  (2)将步骤(1)中的黄芪种子放入MS培养基中进行培养,培养温度为20℃,湿度60%,培养10天进行萌芽,间隔2天更换一次MS培养基;

  所述MS培养基每升含有如下重量的组分:KNO3%205mM,Ca(NO3)2·4H2O%204mM,MgSO4·7H2O%202mM,KH2PO4%201mM,H3BO3%2045μM,MnCl2·4H2O%209μM,ZnSO4·7H2O0.7μM,CuSO4·5H2O%200.2μM,Na2MoO4·2H2O%200.1μM,EDTA-Fe-Na%2040μM;

  (3)将步骤(2)中发芽的黄芪种子加入营养液中继续培养,培养温度为15℃,湿度50%,每天施加黄光12h,间隔6天更换营养液,培养100天;获得高黄酮含量的黄芪幼苗;

  所述营养液每升含有如下重量的组分:

  NH4NO3%208mM,KNO3%206mM,Ca(NO3)2·4H2O%208mM,MgSO4·7H2O%202mM,KH2PO41.3mM,H3BO3%2044μM,MnSO4%209μM,ZnSO4·7H2O%200.8μM,CuCl2%200.4μM,Na2MoO4·2H2O0.12μM,EDTA-Fe-Na%2050μM,烟酸0.5μM,三七提取物90mg。

  其中,三七提取物的制备方法如下:称取10g三七根,加入40g的80%的乙醇水溶液加热回流3h,过滤;将滤液冷冻干燥后制备得到三七提取物。

  实施例3

  一种高黄酮含量的黄芪育苗的方法,包括以下步骤:

  (1)取适量蒙古黄芪种子,加入种子重量4倍的浓度60%的乙醇溶液,超声处理时间60s后;用水清洗4遍;放入冰水中浸泡3h后,取出放入80℃的水中浸泡2h;然后,加入种子重量3倍的1%的升汞溶液浸泡12min后,用水清洗4遍后沥干;

  (2)将步骤(1)中的黄芪种子放入MS培养基中进行培养,培养温度为25℃,湿度60%,培养12天进行萌芽,间隔3天更换一次MS培养基;

  所述MS培养基每升含有如下重量的组分:KNO3%206mM,Ca(NO3)2·4H2O%205mM,MgSO4·7H2O%201.8mM,KH2PO4%201.1mM,H3BO3%2045μM,MnCl2·4H2O%208μM,ZnSO4·7H2O0.6μM,CuSO4·5H2O%200.2μM,Na2MoO4·2H2O%200.2μM,EDTA-Fe-Na%2045μM;

  (3)将步骤(2)中发芽的黄芪种子加入营养液中继续培养,培养温度为20℃,湿度50%,每天施加蓝光12h,间隔4天更换营养液,培养90天;获得高黄酮含量的黄芪幼苗;

  所述营养液每升含有如下重量的组分:

  NH4NO3%208mM,KNO3%207mM,Ca(NO3)2·4H2O7mM,MgSO4·7H2O%201.5-mM,KH2PO41.4mM,H3BO3%2048μM,MnSO4%2010μM,ZnSO4·7H2O%200.6μM,CuCl20.3μM,Na2MoO4·2H2O0.3μM,EDTA-Fe-Na%2060μM,烟酸0.6μM,三七提取物80mg。

  其中,三七提取物的制备方法如下:称取10g三七根,加入30g的70%的乙醇水溶液加热回流3h,过滤;将滤液冷冻干燥后制备得到三七提取物。

  实施例4

  一种高黄酮含量的黄芪育苗的方法,包括以下步骤:

  (1)取适量蒙古黄芪种子,加入种子重量4倍的浓度60%的乙醇溶液,超声处理时间60s后;用水清洗4遍;放入冰水中浸泡3h后,取出放入80℃的水中浸泡2h;然后,加入种子重量3倍的1%的升汞溶液浸泡12min后,用水清洗4遍后沥干;

  (2)将步骤(1)中的黄芪种子放入MS培养基中进行培养,培养温度为25℃,湿度60%,培养12天进行萌芽,间隔3天更换一次MS培养基;

  所述MS培养基每升含有如下重量的组分:KNO3%206mM,Ca(NO3)2·4H2O%205mM,MgSO4·7H2O%201.8mM,KH2PO4%201.1mM,H3BO3%2045μM,MnCl2·4H2O%208μM,ZnSO4·7H2O0.6μM,CuSO4·5H2O%200.2μM,Na2MoO4·2H2O%200.2μM,EDTA-Fe-Na%2045μM;

  (3)将步骤(2)中发芽的黄芪种子加入营养液中继续培养,培养温度为20℃,湿度50%,间隔24h交替施加蓝光和黄光,每天光照12h,,间隔4天更换营养液,培养90天;获得高黄酮含量的黄芪幼苗;

  所述营养液每升含有如下重量的组分:

  NH4NO3%208mM,KNO3%207mM,Ca(NO3)2·4H2O7mM,MgSO4·7H2O%201.5-mM,KH2PO41.4mM,H3BO3%2048μM,MnSO4%2010μM,ZnSO4·7H2O%200.6μM,CuCl2%200.3μM,Na2MoO4·2H2O0.3μM,EDTA-Fe-Na%2060μM,烟酸0.6μM,三七提取物80mg。

  其中,三七提取物的制备方法如下:称取10g三七根,加入30g的70%的乙醇水溶液加热回流3h,过滤;将滤液冷冻干燥后制备得到三七提取物。

  对比例1

  蒙古黄芪种子并未在冰水和80℃水中浸泡,其余步骤与实施例3相同。

  对比例2

  步骤(3)中不施加蓝光,其余步骤与实施例3相同。

  对比例3

  步骤(3)中的营养液中不含有三七提取物,其余步骤与实施例3相同。

  黄芪幼苗中黄酮类化合物的测定方法采用HPLC方法测量,具体提取方法如下:将实施例1-4和对比例1-3中的黄芪幼苗的根部干燥后粉碎,称取样品250mg,加入60%乙醇溶液25ml,回流提取4h,,冷却至室温后,过滤,滤液浓缩干燥,再用乙醇溶解定容至5ml,过0.22μm膜待测。

  萌芽率测试方法:萌芽率=萌芽种子数/总种子数×100%,测试12天后萌芽率,相关实验结果见表1:

  表1

  

  

  从表1的结果来看,本发明所述黄芪育苗方法具有高的萌芽率,12天后萌芽率达到了97%以上,且具有较低的发病率,和发达的根系,说明本发明的黄芪育苗方法具有发芽率高、发病率低和生长周期短的优点。

  进一步可以看出,本申请是营养液能够较好的促进黄芪幼苗的生长,满足其快速生长的需要,且添加三七提取物后能够极大的促进根系和黄酮含量的生长和积累;与此同时,本发明在育苗过程中施加蓝光和黄光,特别是交替施加能够极大的促进黄芪幼苗的生长,提高黄酮含量的积累。

  本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

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