天女木兰提取物 篇一：
天女木兰提取液作为抑菌剂的用途
第一、技术领域
本发明涉及天女木兰提取液的新用途，特别涉及天女木兰提取液作为抑菌剂的用 途。
第二、背景技术
随着生活水平提高，越来越多人开始关注化妆品、食品、保健品中防腐剂安全问 题，传统的防腐剂多为化学合成的，如苯甲酸钠、福尔马林、尼泊金酯、硝酸盐等，其在化妆 品、食品、保健品中存在一些致癌、皮肤刺激等风险。
近年来，一方面，无尼泊金酯类的化妆品多了起来，多以苯氧乙醇或者二元醇系作 为抗菌成分，但是其缺点在于连续使用多元醇防腐体系，皮肤接触多元醇过多，造成多元醇 累加，皮肤会有发热感和刺激感，更甚者皮肤起红斑丘疹;另一方面，虽然人们也知道有很 多种植物具有抗菌作用，但因其特有的抗菌特性，作为化妆品的防腐成分其防腐效果还是 有很多不足，另外植物所特有的颜色以及气味对化妆品的品质有所影响，因此植物提取物 作为防腐成分在化妆品中的使用只限于一部分化妆品。因此，研究开发一种新型高效安全 天然的植物防腐剂，对于化妆品、食品、保健品等领域要重要意义。
天女木兰，属于木兰科木兰属植物，为落叶小乔木，分布在我国东北辽宁及朝鲜、 日本。因花的花瓣洁白、雄蕊紫色、香气迷人、形似天女而得名天女木兰。天女木兰乃珍奇花 木，系太古第四纪冰川期幸存的珍稀名贵花卉，被列入国家濒危植物名录，是我国重点保护 的世界珍惜植物，叶如翠雕，花似玉琢，具有浓郁的芳香，可入药，叶含芳香油，含油量高达 0.2%，是重要的园林绿化树种和提取香料的轻工业原料。中国专利CN1289835A公开了采用 水蒸气蒸馏法从天女木兰叶中提取精天女木兰精油，油香气浓，留香持久，透发性好，略带 醛味;对皮肤无刺激，无毒安全，无副作用，是优质的纯天然香料，可用于调配化妆品、洗涤 品用的香精中，以及药用中。
目前，天女木兰精油被广泛应用为一种优质的纯天然香料，但是对在提取天女木 兰精油过程中产生的废料天女木兰提取液作为抑菌剂的用途的文献未见报道。本发明制备 的天女木兰提取液具有非常强的抑制霉菌和酵母菌能力，有望开发一款纯天然的植物防腐 剂，用于护肤品、食品和保健品中。
第三、发明内容
本发明旨在给出一种天女木兰提取液作为抑菌剂的用途。
优选地，本发明所述的天女木兰提取液作为在化妆品、食品、保健品中的抑菌剂的 用途。
其中，所述抑菌剂的抑菌种类为抑制真菌，优选为抑制霉菌或抑制酵母菌。
其中，所述天女木兰提取液的加入量占化妆品总重量的0.1-1wt%;优选为0.3- 0.8wt%。
当天女木兰提取液的加入量占化妆品总重量超过1wt%，会造成生产过高和浪费， 另外也会对某些配方体系造成一定的风险，如料体变色或者沉淀等等。
其中，所述天女木兰提取液的加入量占食品总重量的0.1-1wt%;优选为0.3- 0.8wt%。
当天女木兰提取液的加入量占食品总重量超过1wt%，会造成生产过高和浪费，还 可能造成食品中营养成分活性下降，在安全方面也存在一定的风险。
其中，所述天女木兰提取液的加入量占保健品总重量的0.1-1wt%;优选为0.3- 0.8wt%。
当天女木兰提取液的加入量占保健品总重量超过1wt%，会造成生产过高和浪费， 还可能造成保健中活性成分活性下降，同时在安全方面也存在一定的风险。
本发明所述的天女木兰提取液可以采用水蒸气蒸馏法制备得到，包括如下步骤： 取天女木兰叶粉碎至10-20目，装在3-5个串联水蒸气蒸馏反应釜中，分散均匀，加上网罩， 通入水蒸气，打开冷凝器，反应1-2h，收集提取物，分离油和水，得到天女木兰提取液。
本发明所述的天女木兰提取液也可以采用水提法制备得到，包括如下步骤：取天 女木兰叶粉碎至30-50目，按照质量体积料液比1:2-1:5加入蒸馏水，同时加入基于天女木 兰叶总质量的1-3wt%的纤维素酶，在50-60℃条件下提取1-3h，过滤，加入基于滤液总质量 的0.5wt%且质量复配比为1:1的活性炭和活性白土的复配脱色剂进行脱色，过陶瓷膜除掉 脱色剂，得到天女木兰提取液。
本发明所述的天女木兰提取液也可以采用醇提法制备得到，包括如下步骤：取天 女木兰叶粉碎至30-50目，按照质量体积料液比1:2-1:4加入体积分数为50-80%的乙醇;在 60-80℃条件下，搅拌，冷凝回流，提取1-3h，过滤，得到滤液。用旋转蒸发仪脱掉滤液里面的 乙醇，至溶液里面无醇味，加水补回蒸发掉的乙醇。加入基于滤液总质量的0.5wt%且质量复 配比为1:1的活性炭和活性白土的复配脱色剂进行脱色，过陶瓷膜除掉脱色剂，得到天女木 兰提取液。
本发明意外的发现，将天女木兰提取液作为抑菌剂添加到化妆品、食品、保健品 中，天女木兰提取液可以显著起到抑制霉菌和酵母菌等真菌的抑菌作用，大大拓宽了天女 木兰提取液在市场中的应用范围。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明采用水蒸气蒸馏、水提法或醇提法制备天女木兰提取液，均是一步法完成，工 艺操作简单，且天女木兰提取液的提取率较高。
2)本发明采用水蒸气蒸馏、水提法或醇提(后续脱醇)法制备天女木兰提取液，制 备得到的天女木兰提取液不含有机溶剂，无有害物质残留，刺激性小，符合绿色天然概念。
3)本发明通过抑(霉)菌测试、抑菌圈实验测试、防腐挑战实验测试天女木兰提取 液的抑菌效果，证实天女木兰提取液可以显著起到抑制霉菌和酵母菌等真菌的抑菌作用， 大大拓宽了天女木兰提取液在市场中的应用范围。
4)将本发明的天女木兰提取液应用到化妆品、食品、保健品中作为抑菌剂，添加量 少，且可以对化妆品、食品、保健品起到抑制霉菌和酵母菌等真菌的抑菌作用。
第四、具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
实施例1：水蒸气蒸馏法制备天女木兰提取液
取50kg天女木兰叶，进行粉碎至20目，装在4个串联水蒸气蒸馏反应釜中，分散均匀，加 上网罩，通入水蒸气，打开冷凝器，反应1h，收集提取物，分离油和水，得到天女木兰提取液 12.8kg。再浓缩一定比例，得到本实验所用的天女木兰提取液。
实施例2：水提法制备天女木兰提取液
取1kg天女木兰叶粉碎至40目，按照质量体积料液比1:3加入蒸馏水，同时加入基于天 女木兰叶总质量的2wt%的纤维素酶，在50-60℃条件下提取2h，过滤，得到滤液，加入基于滤 液总质量的0.5wt%且质量复配比为1:1的活性炭和活性白土的复配脱色剂进行脱色，过陶 瓷膜，得到天女木兰提取液2.4kg。
实施例3：醇提法制备天女木兰提取液
取1kg天女木兰叶粉碎至40目，按照质量体积料液比1:3加入体积分数75%乙醇，在70℃ 条件下，搅拌，冷凝回流，提取2h，过滤，得到滤液。用旋转蒸发仪脱掉滤液里面的乙醇，至溶 液里面无醇味，加水补回蒸发掉的乙醇。加入基于滤液总质量的0.5wt%且质量复配比为1:1 的活性炭和活性白土的复配脱色剂进行脱色，过陶瓷膜除掉脱色剂，得到天女木兰提取液 1.1-3.3kg。
抑菌效果的测试
1.1抑(霉)菌测试
取2012年、2014年、2015年按照实施例1制备的天女木兰提取液，隔0天、7天、14天、21天 和28天分别检测该三种天女木兰提取液里面微生物情况;实验结果如表1所示：
结论：通过一个月的微生物检测显示，每一个批次的天女木兰提取液霉菌指标均为检 出，充分说明天女木兰提取液具有抑制霉菌效果;另外2012年批次天女木兰提取液放置三 年，仍然澄清透明，霉菌检测均充分说明了天女木兰水具有持久性抑制霉菌效果。
抑菌圈实验测试
1.2.1抑菌片的制备
按照要求将抑菌剂(天女木兰提取液)配置成试验所需浓度。取干燥备用的滤纸片，置 37℃温箱或室温干燥备用。(溶出性抗抑菌产品，可直接制成直径为8mm，厚度不超过4mm圆 片)。
1.2.2阴性对照样片的制备
取干燥备用的滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水或抑菌剂溶剂20ul，干燥备用。
1.2.3试验菌的接种
取0.5ml浓度为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml试验菌悬液与无菌培养皿，倒入营养琼 脂培养基于平板并摇匀;盖好平板，置室温干燥5min。
1.2.4抑菌剂样片贴放
用无菌镊子取样片贴放于平板表面，立即滴加20ul抑菌剂。每次试验贴放3个染菌平 板，其中2个平板每个贴放1片试验样片，另外一个平板贴放1片阴性对照样片，贴放好后，盖 好平皿，置37℃培养箱培养16～18h观察结果;用卡尺测量抑菌环的直径(包括贴片)并记 录。(测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行;测量其直径应以抑菌环外沿 为界)实验结果表2所示：
表2天女木兰提取液的抑菌圈测试结果
结论：对于天女木兰提取液作为抑菌剂的抑菌圈测试结果可知，其抑菌环直径为14mm， 与空白对照可知，天女木兰提取液具有很强的抑制霉菌或酵母菌的抑菌效果，对细菌的抑 制效果不明显。
防腐挑战实验测试防腐挑战实验测试
参照美国药典USP30(51)对天女木兰提取液做了一个防腐挑战实验，测试结果如表3所 示：
表3天女木兰提取液的防腐挑战测试结果
结论：经过天女木兰提取液的7天防腐挑战测试结果可知，霉菌和酵母菌的对数减少至 为3.85(基本杀死一半)，14天为4.64,21天霉菌和酵母菌全杀死，表现出非常显著的杀霉菌 和酵母菌的能力;而细菌7天的对数减少值为2.83，后期对数减少基本稳定在3左右，说明对 细菌具有一定的抑制能力，但不显著。
总结：天女木兰提取液具有非常强的抑制霉菌或酵母菌的抑菌效果，但是对抑制 细菌效果一直较弱。
应用实施例1：天女木兰提取液应用于喷雾剂型化妆品
按以下组分及含量配料并制备喷雾剂型化妆品：
主要组分配比(%为质量百分数)
A1水82.00%~91.00%;
A2冰川水1.00%~5.00%;
A3丁二醇1.00%~3.00%;
A4β-葡聚糖0.05%~0.30%;
A5香橙果提取物0.05%~0.30%;
B1水解植物蛋白0.001%~0.003%;
B2卤虫提取物0.001%~0.003%;
C1甘草酸二钾0.001%~0.003%;
SP1天女木兰提取液0.8%。
将上述喷雾剂型化妆品进行28天防腐挑战实验，测试结果如表4所示：
表4喷雾剂型化妆品的防腐挑战测试结果
经过28天防腐挑战实验，上述喷雾剂型化妆品里面的霉菌和酵母菌对数减少值为 4.26，总菌落总数<10cfu/g，说明天女木兰提取液能够有效地抑制喷雾剂型化妆品里面的 霉菌和酵母菌的生长。另外，细菌经过21天的防腐，对数减少为2.70，后期细菌总数基本维 持在2.70左右。说明天女木兰提取液对喷雾剂型化妆品里面的细菌也具有一定的抑制作 用。
应用实施例2：天女木兰提取液应用于面霜剂型化妆品
按以下组分及含量配料并制备面霜剂型化妆品：
主要组分配比(%为质量百分数)
A1水50.00%~55.00%;
A2冰川水1.00%~5.00%;
A3丁二醇1.00%~3.00%;
A4甘草酸二钾0.001%~0.003%;
A51,3-丙二醇5.00%~8.00%;
A6甘油2.00%~4.00%;
A71,2-己二醇0.40%~0.60%;
A81,2-戊二醇1.00%~3.00%;
A9月桂酰胺谷氨酰胺0.40%~0.60%;
B1聚二甲基硅氧烷2.00%~4.00%;
B2鲸蜡醇乙基己酸酯1.00%~4.00%;
B3角鲨烷1.00%~1.50%;
B4山嵛醇1.00%~1.50%;
B5澳洲坚果1.00%~2.00%;
B6鲸蜡硬脂醇2.00%~3.00%;
C1卡波姆3.00%~4.00%;
C2蔗糖硬脂酸酯0.60%~0.80%;
D1银耳提取物0.0004%~0.0006%;
D2β-葡聚糖0.04%~0.06%;
ST1白藜芦醇0.0001%~0.0002%;
SP1天女木兰提取液0.8%。
将上述面霜剂型化妆品进行28天防腐挑战实验，测试结果如表5所示：
表5面霜剂型化妆品的防腐挑战测试结果
经过28天防腐挑战实验，上述面霜剂型化妆品里面的霉菌和酵母菌对数减少值为 4.64，总菌落总数<10cfu/g，说明天女木兰提取液能够有效地抑制面霜剂型化妆品里面的 霉菌和酵母菌的生长。另外，细菌经过28天的防腐，对数减少为5.85，菌落总数<10cfu/g。 说明天女木兰提取液对面霜剂型化妆品里面的细菌也具有一定的抑制作用。
应用实施例3：天女木兰提取液应用于乳液剂型化妆品
按以下组分及含量配料并制备乳液剂型化妆品：
主要组分配比(%为质量百分数)
A1水54.00%~56.00%;
A2甘油5.00%~7.00%;
A3黄原胶0.10%~0.30%;
A4月桂酰胺谷氨酰胺0.08%~0.12%;
B1角鲨烷5.00%~8.00%;
B2聚二甲基硅氧烷5.00%~7.00%;
B3鲸蜡硬脂醇2.00%~3.00%;
B4红花籽油0.50%~1.50%;
B5苯基聚甲基硅氧烷1.00%~2.00%;
C1蔗糖硬脂酸酯0.50%~1.50%;
C2聚丙烯酸2.00%~3.00%;
D1欧洲山杨树皮提取物0.05%~0.15%;
E1茵陈蒿花提取物0.05%~0.15%;
E2丁香花提取物0.05%~0.15%;
F1β-葡聚糖1.50%~2.50%;
F3香橙果提取物0.05%~0.15%;
SP1天女木兰提取液0.8%。
将上述乳液剂型化妆品进行28天防腐挑战实验，测试结果如表6所示：
表6乳液剂型化妆品的防腐挑战测试结果
经过28天防腐挑战实验，上述乳液剂型化妆品里面的霉菌和酵母菌对数减少值为 4.76，总菌落总数<10cfu/g，说明天女木兰提取液能够有效地抑制乳液剂型化妆品里面的 霉菌和酵母菌的生长。另外，细菌经过28天的防腐，对数减少为4.45，说明天女木兰提取液 对乳液剂型化妆品里面的细菌也具有一定的抑制作用。
天女木兰提取物 篇二：
用于皮肤增白的含有天女木兰提取物作为活性成分的化妆品组合物
第一、技术领域
本发明涉及一种含有天女木兰(Magnolia sieboldii)提取物作为活性成分的皮肤增白化妆品组合物，
第二、背景技术
人的皮肤或头发中的色素在保护皮肤或头发免受阳光(尤其是紫外线)的有害影响方面起作用。缺乏这种色素的人对阳光非常敏感，从而他们更可能会受到灼伤。此外，即使很年轻，也有很大的可能性患皮肤癌。已知的是，短波长紫外线(290-320nm)和致癌物质在皮肤上形成有害自由基，例如，氧自由基，并且这种氧自由基攻击皮肤细胞而使皮肤老化。黑色素的主要功能是消除这种有害的自由基，从而保护皮肤免受这种有害的自由基所造成的损伤。因此，具有大量黑色素的人群具有能够保护皮肤免受物理或化学有毒物质损伤的有效防御体系。促进黑色素合成的因素除了阳光(紫外线)之外，还包括雌激素和前列腺素。通过使酪氨酸转化为多巴(dopa)，然后通过酪氨酸酶的酶作用转化为多巴醌，然后进行复合氧化和缩合反应而合成黑色素。合成的黑色素转移到皮肤细胞中，然后，通过表皮剥离失去。这种黑色素合成过程是一种自然现象，在正常状态的人皮肤中不会过度合成。然而，当皮肤受到诸如紫外线、环境污染或应激等外部刺激时，黑色素会过度合成。当过度合成的黑色素残留在皮肤中而没有被排放到皮肤外部时，发生色素沉积。在上述外部刺激中，紫外线是刺激黑色素生物合成的最大来源并能够影响与黑色素合成相关的各种进程。也就是说，紫外线通过促进黑素细胞的活性、刺激黑色素生物合成的激素的分泌、黑色素的氧化或酪氨酸酶的活性而作为诱导黑色素过度合成的一个重要因素。
这种黑色素合成机制的最大特点在于，黑色素合成机制中仅涉及到一种酶，酪氨酸酶。当酪氨酸酶活性受到抑制以防止黑色素合成时，可以预期到皮肤增白效果。
在现有技术中，众所周知的是使用抗坏血酸作为增白物质(日本专利未审公开No.Hei 4-9320)。然而，抗坏血酸的问题在于，其活性随时间推移下降，因为其在制剂中的相稳定性很差。为此，使用胶囊或脂质体来稳定抗坏血酸的各种方法最近已经被提出，但可靠的稳定化方法尚未提出。
此外，众所周知的是使用氢醌作为另一种增白物质(日本专利未审公开No.Hei 6-192062)。氢醌具有优异效果，但是其在化妆品中的用途受到限制，因为它是一种致癌物质。
此外，众所周知的是使用曲酸作为另一种增白物质(日本专利未审公开No.Sho 56-7710)。曲酸由于抑制酪氨酸酶的优异能力而显示出优异的增白效果，但它在制剂稳定性方面具有问题，最近有消息称它是致癌物质。
此外，众所周知的是使用熊果苷作为另一种增白物质(日本专利未审公开No.Hei 4-9315)。熊果苷可以从在高山地带生长的熊果提取，或可以通过合成获得。此外，已经证明它具有抑制酪氨酸酶的能力，象曲酸那样。然而，熊果苷的结构中糖与氢醌结合，它的问题在于，当应用在化妆品中时，糖和氢醌被皮肤酶分离，这样氢醌会诱导皮肤刺激。
本说明书中参考和引用了各种专利和科学论文。引用的专利和科学论文的全部公开内容并入本文作为参考，使得可以更加明确地解释本发明所属技术领域的一般知识和本发明的内容。
第三、实现方法
技术问题
本发明人研究了天然植物组分的各种皮肤生理活性，以改善皮肤色素沉积，结果发现，在天然植物提取物中，天女木兰提取物具有抑制酪氨酸酶活性和黑色素合成的优异效果，不会造成皮肤刺激，并具有非常优异的皮肤增白效果，从而完成了本发明。
技术方案
因此，本发明的一个目的是提供一种含有天女木兰提取物作为活性成分的皮肤增白化妆品组合物。
本发明的另一个目的是提供一种化妆方法，包括向人皮肤施用所述含有天女木兰提取物的化妆品组合物。
从下面的详细说明和所附的权利要求可以更加清楚本发明的其他目的和优点。
有益效果
本发明提供一种含有天女木兰提取物作为活性成分的皮肤增白化妆品组合物。与之前的增白组分相比，本发明的天女木兰提取物具有抑制酪氨酸酶活性和抑制黑素细胞的黑色素合成的优异效果。此外，本发明的含有天女木兰提取物作为活性成分的化妆品组合物具有非常优异的皮肤增白效果。
第四、具体实施方式
本发明提供一种含有天女木兰提取物作为活性成分的皮肤增白化妆品组合物。
天女木兰，其是本发明的化妆品组合物的活性成分，属于木兰科的一种落叶小乔木，从天女木兰的花获得天女木兰提取物。
天女木兰高约7米，其叶子为互生的长椭圆形和玻璃状。其白色的大花在5月和6月向下开放，其果实在9月成熟。它是一种观赏植物，生长在高山的峡谷中，分布在韩国除了咸镜北道(Hamgyeongbuk-do)、日本和中国的各个地区。
用于本发明的天女木兰提取物可以从天女木兰树的花、叶、树枝和根获得，优选从树的花或树枝获得，更优选从花获得。
本发明的天女木兰提取物可以根据本领域中已知的任何常规方法使用常规溶剂在常规温度和压力条件下制备。
作为本发明化妆品组合物的活性成分的天女木兰提取物优选通过用提取溶剂提取而获得，提取溶剂选自水、具有1-4个碳原子的无水或含水低级醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯和1，3-丁二醇，更优选乙醇、丁醇或甲醇，再更优选乙醇。乙醇优选是70%的乙醇。提取溶剂的量优选是天女木兰干重的1-10倍，更优选5-8倍，最优选6倍。
本发明的天女木兰提取物通过包括以下步骤的方法制备：
(a)将干的天女木兰加到提取溶剂中，提取溶剂选自水、具有1-4个碳原子的无水或含水低级醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯和1，3-丁二醇，并且其量是天女木兰干重的1-10倍;
(b)通过在40-100℃下加热3-20小时或在4-40℃下加热1-15天，提取步骤(a)的加入有溶剂的天女木兰;
(c)过滤步骤(b)的提取物，通过在5-10℃下放置7-10天老化滤液，然后另外过滤老化的滤液;和
(d)在旋转式真空蒸发仪中干燥步骤(c)的滤液。
当1，3-丁二醇用作提取溶剂时，在进行提取步骤(b)之后，干重损失被调节到1%(w/w)，因为难于使用旋转式真空蒸发仪干燥滤液。
此外，本发明的天女木兰提取物的范围不仅包括通过上述提取方法获得的提取物，而且还包括通过常规纯化工艺获得的提取物。应该理解，本发明的天女木兰提取物的范围还包括通过各种额外的纯化方法获得的馏分，例如，使用具有规定分子量截留的超滤膜的分离，利用各种色谱系统(根据大小、电荷、疏水性或亲合性制造的用于分离)的分离。
本发明的天女木兰提取物可以通过额外的工艺以粉末形式制备，如真空蒸馏、冷冻干燥或喷雾干燥。
本发明的天女木兰提取物可以通过局部涂布或喷洒在皮肤上而表现出其效果。因此，根据本发明的一个优选实施方案，本发明的组合物可以化妆品组合物的形式制备，包括霜剂、洗剂和皮肤洗剂。
根据本发明的优选实施方案，按皮肤增白化妆品组合物的总重计，本发明的天女木兰提取物的含量为0.00001-30.0wt%，优选0.0001-20.0wt%。如果天女木兰提取物的含量小于0.00001wt%，那么难于显示出其效果，如果含量大于30wt%，有很高的可能性诱导皮肤刺激并且也可能对制剂的稳定性产生很大的不良影响。在本发明的优选实施方案中，制备含有2.0wt%的天女木兰提取物的化妆品组合物，并直接施用在皮肤上，结果，观察到其具有优异的皮肤增白效果。
此外，除了作为活性成分的天女木兰提取物之外，本发明的皮肤增白化妆品组合物还含有化妆品组合物常规使用的组分(例如，常规的添加剂，如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和香料)和载体组分。
本发明的化妆品组合物可以本领域中已知的任何常规制剂形式制备。例如，它可以配制成溶液、悬浮液、乳液、糊剂、凝胶、霜剂、洗剂、粉剂、皂剂、含有表面活性剂的清洁剂、油、粉底霜、乳液底霜、蜡剂底霜和喷雾剂，但本发明的范围不限于此。更具体地说，它可以皮肤洗剂、润肤乳、营养霜、按摩霜、香精、眼霜、清洁霜、清洁泡沫、清洁水、面膜、喷雾剂或粉剂的形式制备。
如果本发明的制剂是糊剂、霜剂或凝胶，其可以含有以下物质作为载体组分：动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石粉或氧化锌。
如果本发明的制剂是粉剂或喷雾剂，其可以含有以下物质作为载体组分：乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末。特别是，如果其是喷雾剂，它可以额外地含有推进剂，如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。
如果本发明的制剂是溶液或乳液，其可以含有以下物质作为载体组分：溶剂、增溶剂或乳化剂，例如，水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油类、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或失水山梨糖醇脂肪酸酯。
如果本发明的制剂是悬浮液，其可以含有以下物质作为载体组分：液体稀释剂(如水、乙醇或丙二醇)、悬浮剂(如乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯)、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪胶。
如果本发明的制剂是含有表面活性剂的清洁剂，其可以含有以下物质作为载体组分：脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺化琥珀酸单酯、羟乙磺酸盐、咪唑鎓衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺基甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化的甘油脂肪酸酯。
在另一方面，本发明提供一种化妆方法，包括向人皮肤施用本发明的含有天女木兰提取物的化妆品组合物。
本发明的化妆方法包括所有包括向人皮肤施用本发明的化妆品组合物的化妆方法。即，本领域中已知的所有包括向皮肤施用化妆品组合物的方法均包括在本发明的化妆方法内。
本发明的化妆品组合物可以单独使用或与其他化妆品组合物组合使用。此外，可以根据任何常规方法使用本发明的具有优异皮肤保护作用的化妆品组合物，并且使用次数可以随使用者的皮肤状况或使用者的嗜好变化。
如果本发明的化妆品组合物是皂剂、含有表面活性剂的清洁制剂或不含有表面活性剂的清洁制剂，则可以在施用到皮肤之后抹去、除去或用水洗去。所述皂剂的具体例子包括但不限于液体皂剂、粉末皂剂、固体皂剂和油状皂剂，所述含有表面活性剂的清洁制剂的例子包括但不限于清洁泡沫、清洁水、清洁巾和清洁面膜，所述不含有表面活性剂的清洁制剂的例子包括但不限于清洁霜、清洁水和清洁凝胶。
进行本发明的化妆方法，包括向人皮肤施用本发明的含有天女木兰提取物的化妆品组合物，可以获得优异的皮肤增白效果。
下面，结合实施例进一步详细说明本发明。然而，应该理解的是，这些实施例仅是说明性的，本发明的范围不限于此。
制备例1：天女木兰提取物的制备I
将用纯净水清洗并干燥的200g天女木兰的花加到1.2L水中，通过在配有冷却冷凝器的提取器中于70-90℃下加热5小时进行提取。然后，通过300-目过滤布过滤提取物，通过在5-10℃下放置7-10天老化，然后通过Whatman No.5滤纸过滤。将滤液在旋转式真空蒸发仪中于65℃下干燥，从而获得干重10.8g。
制备例2：天女木兰提取物的制备II
将用纯净水清洗并干燥的200g天女木兰的花加到1.2L水中，在15-35℃下提取5天，通过300-目过滤布过滤，并通过Whatman No.5滤纸再次过滤。然后，在旋转式真空蒸发仪中将滤液浓缩至一半。然后，将0.6L 100%乙醇加到浓缩物中，通过在5-10℃下放置7-10天老化，然后通过Whatman No.5滤纸过滤。将滤液在旋转式真空蒸发仪中于65℃下干燥，从而获得干重12.5g。
制备例3：天女木兰提取物的制备III
将用纯净水清洗并干燥的200g天女木兰的花加到1.2L水中，在4-40℃下提取5天，通过300-目过滤布过滤，通过在5-10℃下放置7-10天老化，然后通过Whatman No.5滤纸过滤。将滤液在旋转式真空蒸发仪中干燥，从而获得干重10.6g。
制备例4-21：天女木兰提取物的制备IV
将用纯净水清洗并干燥的200g天女木兰的花加到1.2L下表1所示的各提取溶剂中，并按与制备例3相同的方式提取。提取结果列于表1。
表1
制备例 提取溶剂 最终提取物的干重 (单位：g) 制备例4 10%乙醇 12.9 制备例5 20%乙醇 13.3 制备例6 30%乙醇 14.2 制备例7 40%乙醇 13.5 制备例8 50%乙醇 13.6 制备例9 60%乙醇 14.7 制备例10 70%乙醇 15.8
制备例11 80%乙醇 14.5 制备例12 90%乙醇 13.6 制备例13 100%乙醇 12.1 制备例14 甲醇 13.2 制备例15 正丙醇 10.5 制备例16 异丙醇 10.6 制备例17 2-丁醇 11.2 制备例18 丙酮 10.2 制备例19 氯仿 10.5 制备例20 乙酸乙酯 10.6 制备例21 乙酸丁酯 10.3
制备例22：天女木兰提取物的制备V
将用纯净水清洗并干燥的200g天女木兰的花加到1.2L 1，3-丁二醇中，提取48小时，通过300-目过滤布过滤，通过在5-10℃下放置7-10天老化，然后通过Whatman No.5滤纸过滤。提取物经历干重损失，从而获得最终浓度1%(w/v)。
制备例23：天女木兰提取物的制备VI
将用纯净水清洗并干燥的200g天女木兰的花加到1.2L 10%乙醇中，通过在配有冷却冷凝器的提取器中加热5小时进行提取。然后，通过300-目过滤布过滤提取物，通过在5-10℃下放置7-10天老化，然后通过Whatman No.5滤纸过滤。将提取物在旋转式真空蒸发仪中于65℃下干燥，从而获得干重13.8g。
制备例24：天女木兰提取物的制备VII
将用纯净水清洗并干燥的200g天女木兰的花加到1.2L下表2所示的各提取溶剂中，并按与制备例23相同的方式提取。提取结果列于表2。
表2
制备例 提取溶剂 最终提取物的干重 (单位：g) 制备例24 20%乙醇 13.8 制备例25 30%乙醇 13.6 制备例26 40%乙醇 14.9 制备例27 50%乙醇 13.6 制备例28 60%乙醇 14.5
制备例29 70%乙醇 16.3 制备例30 80%乙醇 13.5 制备例31 90%乙醇 14.6 制备例32 100%乙醇 13.8
实验例1：天女木兰提取物的酪氨酸酶活性抑制作用
将磷酸钠缓冲液(pH6.8)中的40μl 1.5mmol/l酪氨酸(Sigma，USA)用作底物，将制备例1-32中制得的各种天女木兰提取物在0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.8)中稀释，从而制得样品溶液。将240μl的各样品溶液加到40μl酪氨酸中，将20μl酪氨酸酶(1500U/ml，Sigma)加到溶液中。然后，使混合物溶液在37℃下反应15分钟，然后在490nm下测量吸光度。这里，没有加入天女木兰提取物的溶液用作对照组。根据以下公式1计算酪氨酸酶活性的抑制率，计算结果列于下表3中：
[数学式1]
酪氨酸酶活性抑制率(%)={1-比较组的吸光度(O.D.490)/对照组的吸光度(O.D.490)}×100
表3
天女木兰提取物的酪氨酸酶活性抑制作用(测试浓度：100μg/ml)
测试物质 酪氨酸酶活性 抑制率(%) 测试物质 酪氨酸酶活性 抑制率(%) 制备例1 45.8 制备例17 52.5 制备例2 50.6 制备例18 56.3 制备例3 52.6 制备例19 54.5 制备例4 54.2 制备例20 58.2 制备例5 55.8 制备例21 53.2 制备例6 50.3 制备例22 54.2 制备例7 48.5 制备例23 50.2 制备例8 49.6 制备例24 55.6 制备例9 50.2 制备例25 52.3 制备例10 51.3 制备例26 50.3 制备例11 52.2 制备例27 55.6 制备例12 50.3 制备例28 54.3 制备例13 52.5 制备例29 58.5 制备例14 56.3 制备例30 58.8 制备例15 58.5 制备例31 59.9 制备例16 51.2 制备例32 60.3
从上表3的结果可以看到，通过各种提取方法获得的天女木兰提取物样品显示出酪氨酸酶活性抑制作用。这表明本发明的含有天女木兰提取物的组合物显示出抑制酪氨酸酶活性的优异效果。
实验例2：天女木兰提取物的黑色素合成抑制作用(黑色素分析)
将B-16细胞(小鼠黑素瘤细胞，Korea Cell Line Bank)接种到12孔板中，密度为1×104细胞/孔，然后培养1天。用不同浓度的天女木兰提取物处理各孔，并培养3-4天，离心每个孔中的培养基。用500μl 1N NaOH的二甲亚砜(DMSO)溶液溶解分离的细胞，并在90℃水浴中加热10分钟。再次离心溶解的细胞，测量上清液在570nm下的吸光度。作为对照组，使用未经天女木兰提取物处理的细胞。根据以下公式2计算黑色素合成的抑制率，计算结果列于下表4中：
[数学式2]
黑色素合成抑制率(%)={1-比较组的吸光度(O.D.490)/对照组的吸光度(O.D.490)}×100
表4
测试物质 黑色素合成抑 制率(%) 测试物质 黑色素合成抑 制率(%) 制备例1 66.8 制备例17 63.6 制备例2 65.7 制备例18 65.2 制备例3 65.3 制备例19 68.3 制备例4 64.3 制备例20 67.5 制备例5 66.7 制备例21 65.3 制备例6 67.3 制备例22 65.3 制备例7 68.6 制备例23 66.3 制备例8 66.7 制备例24 65.5 制备例9 65.3 制备例25 63.3 制备例10 66.3 制备例26 65.2 制备例11 63.2 制备例27 64.2 制备例12 65.3 制备例28 68.3 制备例13 63.4 制备例29 68.5 制备例14 65.3 制备例30 68.7 制备例15 68.5 制备例31 69.8 制备例16 63.2 制备例32 67.3
从上表4的结果可以看到，已经证实天女木兰提取物对于抑制黑素瘤细胞的黑色素合成具有优异效果。此外，在每个测试中，没有观察到细胞毒性。
下面，详细说明本发明的含有天女木兰提取物作为活性成分的化妆品组合物的制剂例，但本发明的化妆品组合物不限于制剂例。此外，以下制剂例中使用的天女木兰提取物是通过在30% 1，3-丁二醇中溶解制备例10的物质至浓度1%(w/v)而得到的物质。
制剂例1：皮肤洗剂
在含有天女木兰提取物的化妆品组合物中，皮肤洗剂制剂示于下表5中。
表5
成分 含量(wt%) 天女木兰提取物 2.0 甘油 5.0 1，3-丁二醇 3.0 PEG 1500 1.0 尿囊素 0.1 DL-泛醇 0.3 EDTA-2Na 0.02 二苯甲酮-9 0.04 透明质酸钠 5.0 乙醇 10.0 Octyl dodeses-16 0.2 聚山梨醇酯20 0.2 防腐剂、香料和颜料 适量 蒸馏水 余量 总量 100
制剂例2：收敛洗剂
在含有天女木兰提取物的化妆品组合物中，收敛洗剂制剂示于下表6中。
表6
成分 含量(wt%) 天女木兰提取物 2.0 甘油 2.0
1，3-丁二醇 2.0 尿囊素 0.2 DL-泛醇 0.2 EDTA-2Na 0.02 二苯甲酮-9 0.04 透明质酸钠 3.0 乙醇 15.0 聚山梨醇酯20 0.3 金缕梅提取物 2.0 柠檬酸 适量 防腐剂、香料和颜料 适量 蒸馏水 余量 总量 100
制剂例3：润肤乳
在含有天女木兰提取物的化妆品组合物中，润肤乳制剂示于下表7中。
表7
成分 含量(wt%) 天女木兰提取物 2.0 硬脂酸甘油酯SE 1.5 硬脂醇 1.5 羊毛脂 1.5 聚山梨醇酯60 1.3 硬脂酸山梨糖醇酯 0.5 氢化的植物油 1.0 矿物油 5.0 角鲨烷 3.0 三辛酸甘油酯 2.0 二甲基硅油 0.8 羧基乙烯基聚合物 0.5 甘油 0.12 1，3-丁二醇 5.0 透明质酸钠 3.0 三乙醇胺 0.12 防腐剂、香料和颜料 适量 蒸馏水 余量 总量 100
制剂例4：营养霜
在含有天女木兰提取物的化妆品组合物中，营养霜制剂示于下表8中。
表8
组分(含量：wt%)实施例1比较例1 天女木兰提取物2.0- 亲脂性甘油单硬脂酸酯2.02.0 鲸蜡硬脂醇2.22.2 硬脂酸1.51.5 蜂蜡1.01.0 聚山梨醇酯601.51.5 硬脂酸山梨糖醇酯0.60.6 氢化植物油1.01.0 角鲨烷3.03.0 矿物油5.05.0 三辛酸甘油酯5.05.0 二甲基硅油1.01.0 硅酸镁钠0.10.1 甘油5.05.0 甜菜碱3.03.0 三乙醇胺1.01.0 透明质酸钠4.04.0 防腐剂、香料和颜料适量适量 蒸馏水余量余量 总量100100
制剂例5：按摩霜
在含有天女木兰提取物的化妆品组合物中，按摩霜制剂示于下表9中。
表9
组分 含量(wt%) 天女木兰提取物 2.0 亲脂性甘油单硬脂酸酯 1.5 硬脂醇 1.5 硬脂酸 1.0 聚山梨醇酯60 1.5 硬脂酸山梨糖醇酯 0.6 异硬脂酸异硬脂基酯 5.0 角鲨烷 5.0 矿物油 35.0 二甲基硅油 0.5 羟乙基纤维素 0.12 甘油 6.0 三乙醇胺 0.7 防腐剂、香料和颜料 适量 蒸馏水 余量 总量 100
制剂例6：香精
在含有天女木兰提取物的化妆品组合物中，香精制剂示于下表10中。
表10
组分含量(wt%) 天女木兰提取物2.0 甘油10.0 甜菜碱5.0 PEG 15002.0 尿囊素0.1 DL-泛醇0.3 EDTA-2Na0.02 二苯甲酮-90.04 羟乙基纤维素0.1 透明质酸钠8.0 羧基乙烯基聚合物0.2 三乙醇胺0.18 辛基十二烷醇0.3 Octyl dodeses-160.4 乙醇6.0 防腐剂、香料和颜料适量 蒸馏水余量 总量100
制剂例7：面膜
在含有天女木兰提取物的化妆品组合物中，面膜制剂示于下表11中。
表11
组分 含量(wt%) 天女木兰提取物 2.0 聚乙烯醇 15.0 纤维素羧甲醚 0.15 甘油 3.0 PEG 1500 2.0 环糊精 0.15 DL-泛醇 0.4 尿囊素 0.1 甘草酸铵 0.3 烟酰胺 0.5 乙醇 6.0 PEG 40，氢化蓖麻油 0.3
防腐剂、香料和颜料 适量 蒸馏水 余量 总量 100
实验例4：测试含有天女木兰提取物的化妆品组合物的增白效果
对19-40年龄的黑皮肤的韩国妇女进行关于本发明的含有天女木兰提取物的化妆品组合物的增白效果的测试。作为测量部位，对受试者胳膊上的3个部位作标记，每个部位的面积为1cm2。两个部位分别施用实施例1的含有天女木兰提取物并根据制剂例4的方法制备的化妆品组合物和比较例1的不含有天女木兰提取物的化妆品组合物，另一个部位用作比较用的对照组。每种化妆品组合物以2周的时间间隔连续施用8周，在8周后，使用Minolta CR 300测量皮肤颜色(L值)。然后，根据公式3计算皮肤颜色的变化(ΔL)，计算结果列于下表12中。
表12
实施例1比较例1ΔL值1.600.50
从显示出8周后皮肤颜色变化(ΔL)的表12可以看到，实施例1的含有天女木兰提取物的化妆品制剂显示出高的增白效果。这表明本发明的含有天女木兰提取物的化妆品组合物具有非常优异的增白效果。
天女木兰提取物 篇三：
用于保护皮肤不受紫外线损伤和改善皮肤皱纹的含有天女木兰花提取物的化妆品组合物
第一、技术领域
本发明涉及一种含有天女木兰(Magnolia sieboldii)提取物作为活性成分的化妆品组合物，更具体而言，涉及一种用于保护皮肤不受紫外线损伤和改善皮肤皱纹(减少皮肤皱纹)的含有天女木兰提取物的化妆品组合物，由此用于保护DNA和皮肤细胞免受紫外线损伤、促进胶原的生物合成并抑制胶原酶的生物合成。
第二、背景技术
对于大多数人来说，在生长阶段皮肤容易受到阳光照射，但是随着年龄增加皮肤组织逐渐变化，因此，由于阳光会发生各种现象，包括皮肤粗糙、皱纹、色斑、不良肤色、腹泻、毛细血管扩张、黑斑、紫癜、容易瘀伤、萎缩、纤维化、变色部位，并且在严重情况下发生恶化前肿瘤和恶性肿瘤。
紫外线分为UVA、UVB和UVC范围，其中只有UVA和UVB能到达地球表面，UVC被臭氧层过滤掉。UVB对皮肤具有最大的影响，并能穿透表皮而损伤皮肤细胞。UVA穿透皮肤真皮而损伤与胶原合成有关的皮肤细胞。这些紫外线直接损伤皮肤或通过产生活性氧而间接损伤皮肤。紫外线对皮肤细胞的影响如下。当皮肤细胞之间的角化细胞受到紫外线照射时，它们分泌炎性细胞因子并诱导氧化应激，从而使各种细胞蛋白激酶和磷脂酶被激活。这些激活的酶水解细胞膜脂质，从而分泌花生四烯酸。分泌的花生四烯酸在环氧化酶的作用下转化为前列腺素E2(PEG2)。形成的花生四烯酸和PGE2与细胞因子一起在皮肤中引起各种炎性反应，包括红斑，从而促进皮肤老化。
此外，皮肤细胞中的纤维原细胞根据与上述角化细胞活化类似的过程被紫外射线激活。在某些情况下，随着紫外线量的增加，纤维原细胞被杀死，或者如果DNA被损坏，其结果会造成皮肤癌并促进皮肤老化。即，因为紫外线可以引起皮肤红斑、免疫抑制、皱纹产生并最终引起皮肤老化和皮肤癌，所以为防止皮肤癌和延迟皮肤老化，阻断和防止紫外线照射是重要的。
近来，由于空气污染和环境污染而使臭氧层破损的原因，到达地球表面的紫外线量增加，并且紫外线的波长范围也改变，使得皮肤老化和皮肤癌增加并且预计未来会进一步增加。因此，在化妆品领域保护皮肤不受紫外线损伤是非常重要的，许多化妆品制造公司已经进行了许多研究来开发相关产品。在目前使用的方法中，简单的紫外线阻断剂或吸收剂被用于保护皮肤不受紫外线损伤，并且最近，据报道，这些紫外线阻断剂本身可以诱导突变而引起皮肤癌。
由于紫外线引起的这些皮肤损伤最终与皮肤老化相关，因此能够防止这些皮肤损伤的方法在化妆品领域受人关注。防止紫外线引起的皮肤损伤的方法包括抑制活性氧或其产生的方法，其他方法包括阻断紫外线。大多数紫外线相关产品的特征在于它们阻断紫外线，并且最近，利用天然物质来抑制紫外线引起的活性氧的方法已被频繁采用。
第三、发明内容
技术问题
本发明人做了许多努力以找到一种生理活性的植物物质，这种物质不仅显示出现有紫外线阻断剂的简单阻断作用，而且没有显示出毒性，并且可以从根本上保护皮肤细胞免受紫外线损伤，从而从根本上防止皮肤老化和皮肤癌。结果，本发明人发现，天女木兰提取物具有保护皮肤免受紫外线损伤的优异效果，从而完成了本发明。
技术方案
因此，本发明的一个目的提供一种用于防止光老化的化妆品组合物，其含有天女木兰提取物作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供一种用于改善皮肤皱纹(减少皮肤皱纹)的化妆品组合物，其含有天女木兰提取物作为活性成分。
本发明的再一个目的是提供一种化妆方法，包括向人皮肤施用所述含有天女木兰提取物的化妆品组合物。
从下面的详细说明和所附的权利要求可以更加清楚本发明的其他目的和优点。
有益效果
本发明提供一种用于防止光老化的含有天女木兰提取物作为活性成分的化妆品组合物。在另一方面，本发明提供一种用于减少皮肤皱纹的含有天女木兰提取物作为活性成分的化妆品组合物。根据本发明的天女木兰提取物可以通过抑制紫外线引起的皮肤细胞死亡和皮肤细胞DNA损伤而保护皮肤免受紫外光损伤，并可以通过促进胶原的生物合成和抑制胶原酶的合成而减少皮肤皱纹。此外，本发明的含有天女木兰提取物的化妆品组合物对于抑制紫外线引起的皮肤损伤具有优异效果，并且对于减少皮肤皱纹具有优异效果。
第四、具体实施方式
根据本发明的一方面，提供一种用于防止光老化的含有天女木兰提取物的化妆品组合物。
根据本发明的另一个方面，提供一种用于改善皮肤皱纹(减少皮肤皱纹)的含有天女木兰提取物的化妆品组合物。
天女木兰，其是本发明的化妆品组合物的活性成分，属于木兰科的一种落叶小乔木，从天女木兰的花获得天女木兰提取物。
天女木兰高约7米，其叶子为互生的长椭圆形和玻璃状。其白色的大花在5月和6月向下开放，其果实在9月成熟。它是一种观赏植物，生长在高山的峡谷中，分布在韩国除了咸镜北道(Hamgyeongbuk-do)、日本和中国的各个地区。
用于本发明的天女木兰提取物可以从天女木兰树的花、叶、树枝和根获得，优选从树的花或树枝获得，更优选从花获得。
用于本发明的天女木兰提取物可以通过本领域中已知的各种方法获得。优选地，可以使用以下溶剂作为提取溶剂获得天女木兰提取物：(a)水、(b)具有1-4个碳原子的无水或含水的低级醇(例如，甲醇、乙醇、丁醇等)、(c)丙酮、(d)乙酸乙酯、(e)氯仿或(f)1，3-丁二醇。提取溶剂更优选是乙醇，更优选约70%的乙醇。用于提取工艺的天女木兰可以在干燥后使用或未经干燥使用。优选地，在干燥后使用。干燥工艺可以是自然干燥或热风干燥。
在本发明的一个优选实施方案中，制备本发明的天女木兰提取物的方法包括：向干燥的天女木兰中加入含水乙醇，在室温下提取含有天女木兰的溶液数天，过滤提取溶液，并在真空下浓缩滤液，从而获得干燥的提取物。
此外，对于本领域技术人员显而易见的是，即使使用所述提取溶剂之外的提取溶剂，也可以获得显示出基本上相同效果的天女木兰提取物。
此外，本发明的天女木兰提取物的范围不仅包括通过上述提取方法获得的提取物，而且还包括通过常规纯化工艺获得的提取物。本发明的天女木兰提取物的范围还包括通过各种额外的纯化方法获得的馏分，例如，使用具有规定分子量截留的超滤膜的分离，利用各种色谱系统(根据大小、电荷、疏水性或亲合性制造的用于分离)的分离。
本发明的天女木兰提取物可以通过额外的工艺以粉末形式制备，如真空蒸馏、冷冻干燥或喷雾干燥。
本发明的天女木兰提取物具有防止皮肤受到诸如紫外线等外部因素引起的皮肤损伤的活性。
UVB对皮肤具有最大的影响，并能穿透表皮而损伤皮肤细胞。UVA穿透皮肤真皮而损伤与胶原合成有关的皮肤细胞。这些紫外线直接损伤皮肤或通过产生活性氧而间接损伤皮肤。
外部因素包括紫外线、应激和外部有害化学物质。这些因素产生自由基(例如，羟基自由基、超氧化物自由基、活性氧和过氧化氢)，增加了皮肤的氧化应激，从而引起炎症、皮肤细胞死亡和皮肤细胞DNA损伤，会导致皮肤癌的发生和促进皮肤老化。
本文中所使用的术语“皮肤损伤”是指皮肤不能执行其正常功能，它包括对皮肤组成(胶原、弹性蛋白等)的损伤、对皮肤细胞功能的损伤和皮肤细胞的死亡。
本文中所使用的术语“皮肤细胞”是指包括存在于皮肤中的所有细胞，优选角化细胞和纤维原细胞。
本文中所使用的术语“保护皮肤”是指包括防止对皮肤的损伤和改善受损的皮肤。
因此，本文中所使用的术语防止紫外线引起的皮肤损伤和保护皮肤免受紫外线损伤，即“光老化防止”，与通过抑制活性氧的产物、促进胶原合成和抑制胶原酶的产生而引起的减少皮肤皱纹具有相同的含义。
本发明的天女木兰提取物可以去除紫外线造成的皮肤的氧化应激，以抑制皮肤细胞死亡和防止DNA损伤，从而保护皮肤。从长期的角度来看，它可以从根本上防止皮肤癌发展和皮肤老化，并能够有效地改善皮肤皱纹。
本发明的天女木兰提取物可以通过局部涂布或喷洒在皮肤上而表现出其效果。因此，根据本发明的一个优选实施方案，本发明的组合物可以化妆品组合物的形式制备，包括霜剂、润肤乳和皮肤洗剂，或以药物组合物的形式制备，包括喷雾剂和油膏。
按组合物总重计，天女木兰提取物在组合物中的含量为0.0001-20.0wt%，优选0.01-10wt%。
当本发明的组合物配制成化妆产品时，除了作为活性成分的天女木兰提取物之外，化妆品组合物还含有化妆品组合物常规使用的组分(例如，常规的添加剂，如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和香料)和载体组分。
本发明的皮肤保护用化妆品组合物可以本领域中己知的任何常规制剂形式制备。例如，它可以配制成溶液、悬浮液、乳液、糊剂、凝胶、霜剂、洗剂、粉剂、皂剂、含有表面活性剂的清洁剂、油、粉底霜、乳液底霜、蜡剂底霜和喷雾剂，但本发明的范围不限于此。更具体地说，它可以皮肤洗剂、润肤乳、营养霜、按摩霜、香精、眼霜、清洁霜、清洁泡沫、清洁水、面膜、喷雾剂或粉剂的形式制备。
如果本发明的制剂是糊剂、霜剂或凝胶，其可以含有以下物质作为载体组分：动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石粉或氧化锌。
如果本发明的制剂是粉剂或喷雾剂，其可以含有以下物质作为载体组分：乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末。特别是，如果其是喷雾剂，它可以额外地含有推进剂，如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。
如果本发明的制剂是溶液或乳液，其可以含有以下物质作为载体组分：溶剂、增溶剂或乳化剂，例如，水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油类、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或失水山梨糖醇脂肪酸酯。
如果本发明的制剂是悬浮液，其可以含有以下物质作为载体组分：液体稀释剂(如水、乙醇或丙二醇)、悬浮剂(如乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯)、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪胶。
如果本发明的制剂是含有表面活性剂的清洁剂，其可以含有以下物质作为载体组分：脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺化琥珀酸单酯、羟乙磺酸盐、咪唑鎓衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺基甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化的甘油脂肪酸酯。
在另一方面，本发明提供一种化妆方法，包括向人皮肤施用本发明的含有天女木兰提取物的化妆品组合物。
本发明的化妆方法包括所有包括向人皮肤施用本发明的化妆品组合物的化妆方法。即，本领域中已知的所有包括向皮肤施用化妆品组合物的方法均包括在本发明的化妆方法内。
本发明的化妆品组合物可以单独使用或与其他化妆品组合物组合使用。此外，可以根据任何常规方法使用本发明的具有优异皮肤保护作用的化妆品组合物，并且使用次数可以随使用者的皮肤状况或使用者的嗜好变化。
如果本发明的化妆品组合物是皂剂、含有表面活性剂的清洁制剂或不含有表面活性剂的清洁制剂，则可以在施用到皮肤之后抹去、除去或用水洗去。所述皂剂的具体例子包括但不限于液体皂剂、粉末皂剂、固体皂剂和油状皂剂，所述含有表面活性剂的清洁制剂的例子包括但不限于清洁泡沫、清洁水、清洁巾和清洁面膜，所述不含有表面活性剂的清洁制剂的例子包括但不限于清洁霜、清洁水和清洁凝胶。
进行本发明的化妆方法，包括向人皮肤施用本发明的含有天女木兰提取物的化妆品组合物，可以获得光老化防止效果和皮肤皱纹减少效果，包括保护DNA和皮肤细胞免受紫外线损伤、促进胶原的生物合成和抑制胶原酶的生物合成。
下面，结合实施例进一步详细说明本发明。然而，应该理解的是，这些实施例仅是说明性的，本发明的范围不限于此。
制备例1：制备天女木兰的花提取物
将100g的天女木兰的干花(购自Kyung Dong Market，Korea)加到1.0L的70%乙醇(乙醇∶水=7∶3)中，在室温下提取3天。过滤提取的溶液，在真空下浓缩滤液，从而得到干燥的提取物(提取率：7.8g/100g)。将干燥的提取物溶解在30%1，3-丁二醇溶液中，至浓度为1%(w/v)，然后过滤。然后，得到的提取物用在本发明的实验中。
制备例2：制备天女木兰的全植物提取物
将100g的天女木兰的干全植物(购自Kyung Dong Market，Korea)加到1.0L的70%乙醇(乙醇∶水=7∶3)中，在室温下提取3天。过滤提取的溶液，在真空下浓缩滤液，从而得到干燥的提取物(提取率：7.0g/100g)。将干燥的提取物溶解在30%1，3-丁二醇溶液中，至浓度为1%(w/v)，然后过滤。然后，得到的提取物用在本发明的实验中。
实验例1：对紫外线引起的角化细胞的细胞死亡的抑制作用
当用紫外线照射角化细胞时，在细胞中产生活性氧。为了人为诱发这种现象，将人正常角化细胞，即Hacat细胞(Korea Cell Line Bank)，接种到48孔微板的每个孔中，密度为1×104细胞/孔，并在DMEM培养基(Sigma，USA)中在37℃下培养24小时。用紫外线(UVB)照射培养的细胞，然后将制备例1的天女木兰提取物加到每个孔的细胞培养物中，浓度为0.1、0.5、1.0和2.0%(v/v)。24小时后，通过MTT检验法来分析细胞的活性。
表1
从上表1可以看出，本发明的天女木兰提取物以浓度依赖性方式抑制紫外线照射引起的角化细胞死亡，并且对于抑制角化细胞死亡表现出优异效果。
实验例2：对紫外线引起的纤维原细胞的细胞死亡的抑制作用
当用紫外线照射纤维原细胞时，产生的活性氧损伤细胞。为了人为诱发这种现象，将人纤维原细胞(Korea Cell Line Bank)接种到48孔微板的每个孔中，密度为1×104细胞/孔，并在DMEM培养基(Sigma，USA)中在37℃下培养24小时。用紫外线(UVA)照射培养的细胞，然后将制备例1的天女木兰提取物加到每个孔的细胞培养物中，浓度为0.1、0.5、1.0和2.0%(v/v)。24小时后，通过MTT检验法来分析细胞的活性。
表2
从上表2可以看出，本发明的天女木兰提取物以浓度依赖性方式抑制紫外线照射引起的纤维原细胞死亡，并且对于抑制纤维原细胞的细胞死亡表现出优异效果。
实验例3：对于紫外线引起的纤维原细胞DNA损伤的抑制作用
当用紫外线照射纤维原细胞时，纤维原细胞的DNA受到损伤。防止纤维原细胞DNA损伤是防止皮肤癌和延迟老化的重要因素。因此，为了检验本发明的天女木兰提取物是否具有抑制纤维原细胞DNA损伤的诱导的作用，进行下面的测试。
将纤维原细胞(Korea Cell Line Bank)接种到24孔孔板的每个孔中，密度为5×104细胞/孔。用紫外线(UVA)照射每个孔中的细胞，然后将制备例1的天女木兰提取物加到每个孔的细胞培养物中，浓度为1.0和2.0%(v/v)。24小时后，对各细胞进行单细胞凝胶电泳(Comet检验)(实施例1和2)。为进行比较，使用未用紫外线照射和未用天女木兰提取物处理的对照组以及用紫外线照射但未用天女木兰提取物处理的比较例(比较例1)。使用图像分析仪(Komet，3.1，Kinetic imaging，England)测量细胞的尾长(μm)，并根据测量结果，分析对DNA的损伤程度。
表3
制备例1的天女木兰提取物 的浓度(v/v%) 平均尾长(μm) 对照组 - 53.1 比较例1 0 152.8 实施例1 1.0 67.5 实施例2 2.0 56.5
从表3可以看出，本发明的天女木兰提取物以浓度依赖性方式抑制紫外线引起的纤维原细胞DNA损伤(参见比较例1及实施例1和2)。其中用2vo1%的制备例1的天女木兰提取物处理细胞的实施例2的结果几乎与对照组的相似。这表明，本发明的天女木兰提取物对于抑制紫外线引起的纤维原细胞DNA损伤具有非常优异的效果。
实验例4：天女木兰提取物对抑制胶原酶产生的影响
按以下方式对实施例中获得的样品进行该实验例。首先，将人正常纤维原细胞接种到48孔微板(Nunc，Denmark)的每个孔中，密度为1×106细胞/孔，并在DMEM培养基(Sigma，USA)中在37℃下培养24小时。然后，用含有不同浓度0.01、0.1、1.0、2.0和5.0%(v/v)的天女木兰提取物(制备例1和2中获得)的无血清DMEM培养基替换培养基，细胞额外培养48小时。为进行比较，细胞在不含有天女木兰提取物的无血清培养基中额外培养(对照例2)。在细胞培养后，收集板的每个孔的上清液，使用胶原酶检测试剂盒(Amersham，USA)测量上清液中胶原酶的产生。测量结果示于下表4中。
表4 天女木兰提取物对抑制胶原酶产生的影响
制备例1的天女木兰的 花提取物(v/v%) 制备例2的天女木兰的 全植物提取物(v/v%) 胶原酶的产生 对照例2 - - 2.358 实施例3 0.01 - 2.058 实施例4 0.10 - 1.944 实施例5 1.00 - 1.356 实施例6 2.00 - 1.325 实施例7 5.00 - 1.365 实施例8 - 0.01 2.301 实施例9 - 0.10 2.213 实施例10 - 1.00 2.015 实施例11 - 2.00 1.989 实施例12 - 5.00 1.825
从表4的结果可以看出，本发明的天女木兰提取物抑制胶原酶的产生，不同于未经任何处理的对照例2。从实施例3～7和实施例8～12的结果可以看出，本发明的天女木兰提取物以浓度依赖性方式抑制胶原酶的产生。此外，可以观察到，在抑制胶原酶产生方面天女木兰的花提取物优于天女木兰的全植物提取物。
实验例5：天女木兰提取物对促进胶原合成的影响
将人正常纤维原细胞接种到48孔微板的每个孔中，密度为1×106细胞/孔，并在DMEM培养基中在37℃下培养24小时。然后，用含有不同浓度0.01、0.10、1.0、2.0和5.0v/v%的天女木兰提取物(制备例1和2中获得)的无血清培养基替换培养基，然后细胞额外培养24小时(实施例13～22)。为进行比较，细胞在不含有天女木兰提取物的无血清DMEM培养基中额外培养24小时(对照例2)。在细胞培养后，收集每个孔的上清液，通过使用试剂盒(Takara，Japan)测量I型前胶原羧基端肽(PICP)的量来分析上清液中新合成的胶原的量。测量结果示于下表5中。
表5 天女木兰提取物对促进胶原合成的影响
制备例1的天女木兰 的花提取物(v/v%) 制备例2的天女木兰的 全植物提取物(v/v%) 胶原产生 (在450nm下的吸光度) 对照例3 - - 1.235 实施例13 0.01 - 1.356 实施例14 0.10 - 1.458 实施例15 1.00 - 1.985 实施例16 2.00 - 2.246 实施例17 5.00 - 2.865 实施例18 - 0.01 1.236 实施例19 - 0.10 1.385 实施例20 - 1.00 1.754 实施例21 - 2.00 1.985 实施例22 - 5.00 2.136
从上表5的结果可以看出，与未经任何处理的对照例3相比，本发明的天女木兰提取物在胶原产生方面表现出很大的增加。这表明，本发明的天女木兰提取物对于促进胶原产生具有优异效果。此外，从实施例13～17和实施例18～22的结果可以看出，本发明的天女木兰提取物以浓度依赖性方式促进胶原的产生，并且象实验例4的情况那样，在促进胶原产生方面天女木兰的花提取物优于天女木兰的全植物提取物。
制备例1中获得的天女木兰的花提取物用于以下制剂例中，但可以使用制备例2中获得的天女木兰的全植物提取物。
制剂例1：皮肤洗剂
在含有天女木兰提取物的化妆品组合物中，皮肤洗剂制剂示于下表6中。
表6
成分 含量(wt%) 制备例1中获得的天女木兰的花提取物 0.5 1，3-丁二醇 5.2 油醇 1.5 乙醇 3.2 聚山梨醇酯20 3.2 二苯甲酮-9 2.0
羧基乙烯基聚合物 1.0 甘油 3.5 香料 适量 防腐剂 适量 纯净水 余量 总量 100
制剂例2：润肤乳
在含有天女木兰提取物的化妆品组合物中，润肤乳制剂示于下表7中。
表7
成分 含量(wt%) 制备例1中获得的天女木兰的花提取物 0.6 甘油 5.1 丙二醇 4.2 生育酚乙酸酯 3.0 液体石蜡 4.6 三乙醇胺 1.0 角鲨烷 3.1 澳大利亚坚果油 2.5 聚山梨醇酯60 1.6 失水山梨糖醇倍半油酸酯 1.6 对羟基苯甲酸丙酯 0.6 羧基乙烯基聚合物 1.5 香料 适量 防腐剂 适量 纯净水 余量 总量 100
制剂例3：营养霜
在含有天女木兰提取物的化妆品组合物中，营养霜制剂示于下表8中。
表8
成分 含量(wt%) 制备例1中获得的天女木兰的花提取物 1.0 甘油 4.0 凡士林 3.5 三乙醇胺 2.1 液体石蜡 5.3 角鲨烷 3.0
蜂蜡 2.6 生育酚乙酸酯 5.4 聚山梨醇酯60 3.2 羧基乙烯基聚合物 1.0 失水山梨糖醇倍半油酸酯 3.1 香料 适量 防腐剂 适量 纯净水 余量 总量 100
制剂例4：按摩霜
在含有天女木兰提取物的化妆品组合物中，按摩霜制剂示于下表9中。
表9
成分含量(wt%) 制备例1中获得的天女木兰的花提取物0.5 甘油4.0 凡士林3.5 三乙醇胺0.5 液体石蜡24.0 角鲨烷3.0 蜂蜡2.1 生育酚乙酸酯0.1 聚山梨醇酯602.4 羧基乙烯基聚合物1.0 失水山梨糖醇倍半油酸酯2.3 香料适量 防腐剂适量 纯净水余量 总量100
制剂例5：面膜
在含有天女木兰提取物的化妆品组合物中，面膜制剂示于下表10中。
表10
成分 含量(wt%) 制备例1中获得的天女木兰的花提取物 1.0 乙醇 3.0 EDTA-2Na 0.02 丙二醇 5.1
甘油 4.5 Carbopol 1.0 多氧化物 0.1 防腐剂 适量 香料 适量 纯净水 适量 总量 100
实验例6：对保护皮肤免受紫外线损伤的影响
为了检验本发明的含有本发明的天女木兰提取物化妆品组合物是否对保护皮肤免受紫外线损伤具有影响，进行以下测试。首先，用紫外线(1.5MED)人为照射人皮肤，然后将制剂例3中制备的营养霜以6小时间隔涂布到人皮肤上。作为比较例，使用与制剂例3相同但不含有天女木兰提取物的组合物。对20个人进行测试，通过在紫外线照射48小时后目视评价和仪器评价来分析红斑的产生。使用皮肤色度计(Minolta，Japan)进行仪器评价，评价结果示于下表11中。
表11
*使用前：用紫外线照射前;
**使用后：用紫外线照射48小时后;
***值：表明皮肤上的红斑产生，并以20个人的平均值表示。
从上表11的结果可以看出，与不含有天女木兰提取物的制剂相比，含有本发明的天女木兰提取物的制剂在红斑产生方面表现出明显降低。这表明，本发明的天女木兰提取物对于抑制紫外线引起的皮肤损伤具有非常优异的效果。
实验例7：评价含有天女木兰提取物的化妆品组合物的皮肤皱纹减少效果
通过实际使用测试来评价本发明的化妆品组合物的皮肤皱纹减少效果。在测试中，使用含有1%(v/v)的制备例1的天女木兰提取物的制剂例3的营养霜和通过用纯净水代替制剂例3的营养霜中的天女木兰提取物而获得的霜剂。对30名妇女进行测试，将制剂例3的营养霜涂布到每个测试者的一面上，将比较例的霜剂涂布到另一面上。6周后，由专业小组目视评价每个测试者表面上的皱纹减少程度，评价结果示于下表12中。
表12
含有天女木兰提取物的营养霜的皱纹减少效果(目视评价)
从上表12可以看出，与不含有天女木兰的比较例的霜剂相比，含有本发明的天女木兰提取物的比较例3的营养霜对于减少皱纹表现出优异效果。此外，在涂布本发明的化妆品组合物的大多数测试者的皮肤中没有观察到皮肤刺激。
天女木兰提取物 篇四：
天女木兰复合天然防晒霜及其制作方法
第一、技术领域
本发明涉及一种天女木兰复合天然防晒霜及制作方法，尤其是利用天女木 兰精油、天女木兰等植物黄酮类化合物提取物以及复合动植物油脂为原料制备复 合天然防晒霜，本发明属于化妆品领域。
第二、背景技术
有关文献记载：何西利等在西北药学杂志，13(6)，157-258，1998中报 道长时间受日光照射会出现皮肤灼痛红肿、脱皮和老化等现象，光敏感者可呈现 皮炎、红疹以至发生皮癌。这是日光中紫外线引起的损害。波长为290nm-320nm 的紫外线(UVB)能灼伤皮肤，320nm-400nm的紫外线(UVA)使皮肤晒黑。市售防晒 剂多为合成产品，一些产品尚存在不安全因素。从槐米中提取芦丁和从黄芩中提 取黄岑苷，制成防晒霜，试用一年，防晒效果好，无明显副作用。李艳等在中草 药，30(9)，671-673，1999中报道从银杏叶中提取的黄酮苷类可以显著抑制线 粒体膜流动性下降和细胞色素C氧化酶活力下降的变化，从而保护紫外线引起的 线粒体结构和功能的损伤。
张绪成等在吉林林业科技，103(2)，13-15，1993中报道天女木兰鲜叶精 油清香略带醛香气、透发性好、留香较持久、安全无毒。可用作日化洗涤用品香 料原料。天女木兰精油中抗癌活性成分β-榄香烯为主要成分(25%)，是一种值 得开发的功能性精油。
华斌耀等在现代应用药理学，11(6)，20，1994中报道貂油天然脂肪具有 多种营养成份，其理化特性与人体脂肪接近，具有良好的渗透性，易被皮肤吸收， 使皮肤柔软且有弹性，故保温、防冻、防裂;杨花等在宁夏农林科技，52(4)， 61-62，2011中报道獾油能加速烫伤创面的再上皮化，促进创面的愈合，提高烫 伤组织细胞的增殖活性，促进创面的再上皮化和表皮各层的分化，同时獾油性味 甘酸，具有清热解毒、消肿止痛、润滑养阴、生肌护肤止痛、保持创面湿润等作 用。
欧阳娜娜等在时珍国医药，23(5)，1155-1156，2012中报道了将超声波 提取技术用于银杏黄酮的提取;卢锦花等在应用化学，19(5)，2002中报道了 DM-130大孔树脂提取黄酮的方法。
现有技术中，将植物黄酮类提取物用于制作防晒霜的原料，起到吸收紫外 线的作用，以天女木兰鲜叶中的精油为原料进行化妆品的研制，獾油、貂油可用 于化妆品中。现有文献中未有以天女木兰叶黄酮类成分提取物为主的复合黄酮植 物提取物为原料辅以动物复合油脂进行化妆品的研究报道。
第三、发明内容
本发明的目的：为了吸收能灼伤皮肤波长为290nm-320nm的紫外线(UVB) 与使皮肤晒黑波长为320nm-400nm的紫外线(UVA)，本发明制作了一种含天女木 兰等复合植物黄酮化合物提取物与貉油等复合动植物油的天然护肤防晒霜，这种 防晒霜对200nm-400nm范围内的紫外线具有强吸收作用，利用天女木兰等多种植 物提取的具有吸收紫外线、抗氧化作用的植物复合黄酮类化合物，利用貉油、獾 油等多种动植物油脂复配的具有促进创面的再上皮化和表皮各层的分化活性及 生肌护肤止痛、保持创面湿润等作用的动植物复合油脂进行天然防晒霜的制备， 克服了目前市场上紫外吸收谱相对较窄以及对促进创面的再上皮化和表皮各层 的分化活性和及生肌护肤止痛、保持创面湿润及保温、防冻、防裂等作用不能兼 备的难题。
本发明主要利用以天女木兰等植物黄酮类化合物提取液，与人体脂肪接近 的貂油及具有生肌护肤止痛、保持创面湿润作用的獾油复配，从而得到一种新型 的含有吸收紫外线的植物黄酮，保温、防冻、防裂脂肪酸组成的动植物复合油脂 的天然防晒霜。
第四、本发明采用如下技术方案：
一种天女木兰复合天然防晒霜，包括如下组分：以植物提取物及动植物油等 构成的组分A、以甘油及水等构成的组分B和精油为主的组分C;其中组分A包 括植物复合黄酮类化合物提取物、动植物复合油脂、羊毛脂、白油、凡士林、液 体石蜡、蜂蜡、硬脂酸、十八醇、单硬脂酸甘油酯、斯盘-80、十六醇、尼泊金 甲酯、尼泊金乙酯，质量分数分别为2.5-7.5%、1.5-3.1%、8-12%、8-10%、6-10%、 6-10%、4.5-10%、6-8%、4-8%、2-5%、2-4%、1-3%、0.05-0.2%、0.05-0.2%;组 分B包括甘油、三乙醇胺、吐温-60、硼砂，质量分数分别为4-6%、0.5-1%、2-4%、 0.6-1%，余量为水;组分C包括天女木兰精油或天女木兰超临界精油、天然玫瑰 香精，质量分数分别为0.5-1%、0.1-0.5%。
其中：组分A中的植物复合黄酮类化合物提取物是由质量比为 40-80:20-50:10-30的天女木兰黄酮类化合物提取物、槐米黄酮类化合物提取 物、黄芩黄酮类化合物提取物复合而成。
其中：组分A的动植物复合油脂，包括貉油、獾油、貂油、牛油、鸡油、 葵花籽油、南瓜籽油，其中獾油质量分数不低于20%。
天女木兰复合天然防晒霜的制备方法包括以下步骤：
(1)将组分A与组分B分别加热至75℃-90℃，并搅拌均匀;
(2)把组分B加入到组分A中，剧烈保温搅拌10-30min，充分乳化;
(3)边搅拌边冷却，待温度降低到40℃-50℃时，加入组分C，温度降至 40℃以下时停止搅拌，即成为天女木兰复合天然防晒霜。
天女木兰天然复合防晒霜具体的制作包括如下步骤：
a.天女木兰精油的制备：以天女木兰鲜叶为材料，采用乙醚回流方式提取， 料液比按质量比1:5-8，提取液真空浓缩至浸膏状，再按浸膏、水质量比为 1:10-20加纯净水搅拌，采用正己烷萃取，按正己烷、水体积比为1:100，过夜 后收集上层油状物即为天女木兰精油。
b.天女木兰黄酮类化合物提取液的制备：取天女木兰精油提取的残渣，加 入体积分数为70%的食用酒精，采用超声波提取，回收酒精至酒精残留量在体积 分数5%以下，用大孔树脂吸附，以纯净水洗去杂质，再用体积分数为95%的食用 酒精洗脱，回收乙醇，干燥后得到天女木兰黄酮类化合物提取物。
c.槐米黄酮类化合物提取物的制备：槐米粉碎后，经过石灰水提取、酸沉、 水洗、乙醇洗出、丙酮脱脂脱色、干燥制得槐米黄酮类化合物提取物。
d.黄芩黄酮类化合物提取物的制备：黄芩经粉碎体积分为60%乙醇回流提 取，回收乙醇得到残留乙醇体积分数5%以下的水溶液，用体积比1:1的盐酸水 溶液调整酸度(控制pH值在1-2范围)保温(80℃)酸沉，离心取沉淀，加入 10倍水悬浮，用20%NaOH溶液调整pH值为,7.0-7.2，离心后取上清液，按等体 积加入无水乙醇，静止沉淀，离心取上清液，用体积比1:1的盐酸水溶液调整酸 度(pH值在1-2范围)保温(80℃)酸沉，离心取沉淀，干燥后得到黄芩黄酮 类化合物提取物。
e.植物复合黄酮类化合物提取物的制备：
植物黄酮类化合物提取物的紫外吸收特征：按上述工艺提取的天女木兰黄 酮类化合物提取物的紫外吸收特征为200nm-500nm之间均有较强的宽吸收带， 650nm-700nm之间有一个强吸收峰;按上述工艺提取的槐米黄酮类化合物提取物 的紫外吸收特征为在202nm、206nm、208nm、210nm、258nm、367nm，以367nm 为典型吸收峰处有较强的吸收带;按上述工艺提取的黄芩黄酮类化合物提取物的 紫外吸收特征为在210nm、290nm与320nm有较强的吸收带，以320为典型吸收 峰。
植物复合黄酮类化合物提取物的复配原则：为了在防晒霜中更好地发挥各 自吸收紫外线的作用，采用以紫外吸光度控制下的黄酮类化合物提取物的质量 比，确定复合黄酮类化合物中三种黄酮类化合物提取物的复合比。
复配具体过程：称取一定质量的样品配制成浓度为0.5g/L的乙醇溶液在 320nm、330nm、340nm、350nm、360nm处测得吸光度值，并用无水乙醇调整溶液 浓度(浓度用g/L表示)并使得天女木兰黄酮类化合物在320nm、330nm、340nm、 350nm、360nm处测得吸光度平均值为0.5，槐米黄酮类化合物在350nm与360nm 处测得吸光度平均值为0.5，黄芩黄酮类化合物在320nm与330nm处测得吸光度 平均值为0.5。这样，所得到的溶液浓度之比则为复合黄酮类化合物提取物的质 量比，按此质量比混合得到植物复合黄酮类化合物提取物。
f.动植物复合油脂的制备：
复配依据：将理化特性与人体脂肪接近，具有良好的渗透性易被皮肤吸收， 使皮肤柔软且有弹性，故保温、防冻、防裂作用的貉油以及能加速烫伤创面的再 上皮化，促进创面的愈合，提高烫伤组织细胞的增殖活性，促进创面的再上皮化 和表皮各层的分化，同时獾油性味甘酸，具有清热解毒、消肿止痛、润滑养阴、 生肌护肤止痛、保持创面湿润等作用的獾油为基础油脂进行复配。
复配原则：主要解决既能够增加獾油的比例，又能够保持貉油的脂肪酸组 成。为此，提出负赔指数的概念。先测定各复配油脂的脂肪酸组成，并将貉油的 主要成分按棕榈酸、硬脂酸、油酸与亚油酸四种脂肪酸的组成为基数，再添加等 质量的獾油进行混合，得到的油脂按公式1计算，得到相似度指数为k1，在添加 其它动植物油脂调整k值，得到一个较小的k2，按公式2计算油脂复合指数M。
按着油脂复合指数大于2.0的原则确定动植物油脂的复合比。
K=Σi=1nAi(|x1i-x0|(x1i)+(|x2i-x0|/(x2i)+(|x3i-x0|/(x3i)+(|x4i-x0|/(x4i))/A---
---公式1
公式1中：
其中k为复配系数，表示复配油脂与貉油脂肪酸组成的相似度;
i代表第i种油脂;
Ai为第i种油脂的质量数(以g表示);
A代表复配油脂的总量(以g表示);
x1i，x2i，x3i，x4i分别代表第i种油脂的棕榈酸、硬脂酸、油酸与亚油酸脂 肪酸组成。
M=(k1-k2)/k2---公式2
公式2中：
M为油脂复合指数;k1为貉油与獾油等质量混合后得到的油脂相似度指数， k2为添加其它油脂后得到的油脂相似度指数。
复配的动植物油脂：以貉油、獾油为基础，按着上述复配原则确定貂油、 猪油、牛油、羊油、马油、兔油、鸡油、鸭油、鹅油等动物油以及山核桃油、红 松籽油、接骨木油、松子油、苹果籽油、韭菜籽油、南瓜籽油、月见草油、苏子 油、橄榄油、花生油、大豆油、葵花籽油等植物油。
g.组分A的制备：
植物复合黄酮类化合物提取物、动植物复合油脂、羊毛脂、白油、凡士林、 液体石蜡、蜂蜡、硬脂酸、十八醇、单硬脂酸甘油酯、斯盘-80、十六醇、尼泊 金甲酯、尼泊金乙酯，质量分数分别为2.5-7.5%、1.5-3.1%、8-12%、8-10%、 6-10%、6-10%、4.5-10%、6-8%、4-8%、2-5%、2-4%、1-3%、0.05-0.2%、0.05-0.2% 混合。
植物复合黄酮类化合物提取物中天女木兰黄酮类化合物提取物、槐米黄酮 类化合物提取物、黄芩黄酮类化合物提取物质量比为：40-80:20-50:10-30，并 按上述植物复合黄酮类化合物提取物复合原则进行制备。
动植物复合油脂包括貉油、獾油、貂油、牛油、鸡油、葵花籽油、南瓜籽 油、猪油、羊油、马油、兔油、鸭油、鹅油、山核桃油、红松籽油、接骨木油、 松子油、苹果籽油、韭菜籽油、月见草油、苏子油、橄榄油、花生油、大豆油的 质量比为40-50:40-50:10-20:6-20:3-20：8-20:4-20:0.2-20:0.2-20:0.2-20: 0.2-20:0.2-20:0.2-20:0.2-20:0.2-20:0.2-20:0.2-20:0.2-20:0.2-20:0.2-20 :0.2-20:0.2-20:0.2-20:0.2-20。
h.组分B的制备：将甘油(质量分数为4-6%)、三乙醇胺(质量分数为 0.5-1.0%)、吐温-60(质量分数为2-4%)、硼砂(质量分数为0.6-1%)、余量为 水。
i.组分C的制备：将上述工艺提取的天女木兰精油或天女木兰超临界精油 以在成品中的质量分数为0.5-1%与10%的蜂胶乙醇溶液质量分数为1.5-2.5%、 天然玫瑰香精质量分数为0.1-0.5%混合备用。
j.防晒霜的制备：分别将组分A与组分B加热至75℃-90℃，把组分B加 入到组分A中，剧烈搅拌(保温搅拌10-30min)，边搅拌边冷却，待温度降低到 42℃-45℃时，加入组分C，40℃以下时停止搅拌，即成为防晒霜。
本发明的方法是以天女木兰、槐米和黄芩三种植物提取得到的黄酮类化合 物提取物为主要原料，具有明显的广谱性强紫外吸收作用;配方中的羊毛脂的分 子结构和人类分泌的油脂结构非常相似,是护肤品原料中的圣品;獾油、貉油等 复合油脂中既可保证獾油的相对含量，又保持了貉油的脂肪酸组成，兼有促进创 面的再上皮化和表皮各层的分化活性及生肌护肤止痛、保持创面湿润及保温、防 冻、防裂等作用。经本发明方法制作的天女木兰复合天然防晒霜于4℃冰箱保存 3个月，取0.1g防晒霜溶于100mL乙醇并过滤，在360nm、350nm、340nm、330nm、 320nm处吸光度值的平均值，保存6个月前后的吸光度值三次平均值分别为 0.1582与0.1479，可以看出，天女木兰防晒霜具有明显的紫外吸收作用，并且 在4℃冰箱保存3个月后，紫外吸收未发生明显变化，说明天女木兰复合天然防 晒霜的活性基本稳定，能够满足市场的需要。
第五、具体实施方式
下面给出的具体实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不 以任何方式限制本发明。
实施例1
植物复合黄酮类化合物提取物的制备
称取0.50g天女木兰黄酮类化合物提取物，溶于20mL乙醇中，得到25g/L 的溶液，分别取0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL，用乙醇定容至50mL，得 到梯度溶液，分别测定吸光度值，结果见表1。以溶液浓度与吸光度值平均值作 图，得线性回归方程为：y=2.1185x+0.3861，R2=0.9955，其中x为溶液浓度，y 为吸光度值，将x=0.5代入方程得y=0.05375，取近似值为0.050。
称取0.50g槐米黄酮类化合物提取物，溶于20mL乙醇中，得到25g/L的溶 液，分别取0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL，用乙醇定容至250mL，得到 梯度溶液，分别测定的吸光度值，结果见表2。以溶液浓度与吸光度值平均值作 图，的线性回归方程为：y=5.6316x+0.057，R2=0.9772，其中x为溶液浓度，y 为吸光度值，将y=0.5代入方程得y=0.031，取近似值为0.030。
称取0.50g黄芩黄酮类化合物提取物，溶于100mL乙醇中，得到5g/L的溶 液，分别取0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL，用乙醇定容至500mL，得到 梯度溶液，分别测定吸光度值，结果见表2。以溶液浓度与吸光度值平均值作图， 得线性回归方程为：y=32.97x+0.0123，R2=0.9801，其中x为溶液浓度，y为吸 光度值，将y=0.5代入方程得y=0.01497，取近似值为0.015。
天女木兰、槐米和黄芩三种黄酮类化合物提取物的复合质量比为 0.050:0.030:0.015，即50:30:15按此比例，称取三种黄酮类化合物提取物分别 为天女木兰50g、槐米30g以及黄芩15g混匀即可。
表1 不同浓度天女木兰黄酮类化合物提取物吸光度值测定表
表2 不同浓度槐米黄酮类化合物提取物吸光度值测定表
表3 不同浓度黄芩黄酮类化合物提取物吸光度值测定表
实施例2
动植物复合油脂的制备:
首先测定各种油脂的脂肪酸组成，分别取貉油、獾油各50g，依据脂肪酸 组成，按上述公式1计算得调整前相似度k1=3.1，经过大量计算，最后确定了貉 油50g、獾油50g、牛油28g、貂油15g、南瓜籽油15g、葵花籽油12g、鸡油10g、 猪油1g、羊油0.5g、马油0.7g、兔油0.4g、鸭油0.5g、鹅油0.3g、山核桃油 0.5g、红松籽油0.5g、接骨木油0.5g、松子油0.5g、苹果籽油0.5g、韭菜籽油 0.3g、月见草油0.5g、苏子油0.5g、橄榄油1.2g、花生油0.5g、大豆油0.5g。 并计算得调整后相似度k2=0.83，将k1与k1代入公式2得油脂复合指数M=2.73， 该值大于2.0，说明调整后的油脂与貉油脂肪酸组成相似度较高，符合油脂复合 原则，可以按着上述质量进行油脂的调配。
实施例3
天女木兰复合天然防晒霜的制备：
组分A:称取植物复合黄酮类化合物提取物(天女木兰、槐米与黄芩黄酮类 化合物的质量配比为50:30:15)3g、动植物复合油脂(由貉油50g、獾油50g、 牛油28g、貂油15g、南瓜籽油15g、葵花籽油12g、鸡油10g以及其它动植物油 脂9g混合而成)2.1g混合均匀后，再加入羊毛脂10g、白油9g、凡士林8g、液 体石蜡8g、蜂蜡6g、硬脂酸7g、十八醇6g、单硬脂酸甘油酯3g、斯盘-803g、 十六醇2g、尼泊金甲酯0.1g、尼泊金乙酯0.1g混合均匀，制得组分A。
组分B：称取甘油5g，三乙醇胺0.7g、吐温-603g、硼砂0.8g，余量为水 (所有组分质量总和为100g)，混合均匀即为组分B。
组分C：称取天女木兰精油0.3g、天然玫瑰香精0.1g、10%的蜂胶乙醇溶 液2g混匀，得到组分C。
分别将组分A与组分B加热至85℃，把组分B加入到组分A中，剧烈搅拌 (保温搅拌20min)，边搅拌边冷却，待温度降低到43℃时，加入组分C，40℃ 时停止搅拌，即成为天女木兰复合天然防晒霜。
天女木兰提取物 篇五：
一种预防天女木兰芽组培褐化的培养基配方及方法
第一、技术领域
本发明属于组织培养领域，涉及一种预防天女木兰芽组培褐化的培养基配方及方 法。
第二、背景技术
天女木兰(MagnoliasieboldiiK.Koch)是木兰科(Magnoliaceae)木兰属 (Magnolia)的落叶小乔木，国家三级濒危树种。天女木兰兼有观赏、芳香和药用价值,是一 种很有开发前景的珍稀野生木本植物资源。
天女木兰芽组织培养过程中，外植体褐化现象经常发生。褐化严重影响外植体的 脱分化和再分化，造成培养失败，这已成为天女木兰组织培养中的棘手问题，同时也成为天 女木兰快繁体系建立的一大障碍,目前还没有令人满意、有效防止天女木兰组培褐化现象 的方法。
天女木兰褐化产生的机理与许多木本植物相同，褐化主要是多酚氧化酶(PPO)作 用于天然底物酚类物质引起的;PPO是植物体中普遍存在的一种末端氧化酶，正常情况下细 胞内的酚类物质和PPO呈区域性分布，酚类物质分布在液泡中，PPO分布在质体和细胞质中 且与膜结合呈潜伏状态;当外植体被切割时，膜结构瓦解，PPO受到活化与酚类物质接触，将 酚氧化成醌类物质产生褐化现象。醌类物质在酪氨酸酶的作用下，与外植体中的蛋白质发 生聚合，引起其他酶系统失活，导致代谢紊乱，生长受阻。根据现有文献人们进行天女木兰 组织培养通常采用B5培养基，其原因是B5培养基相对MS等其它类型培养基褐化较轻(杜凤 国2007年)。目前预防天女木兰芽组培褐化现象，主要采取以下二种方法。1、培养基中添加 抗氧化剂，比如：维生素C和半胱氨酸等抗氧化剂，其作用是防止外植体释放的酚类物质被 氧化，对酚类物质具有保护作用;2、在培养基中加入吸附剂，比如：活性炭或聚乙烯比咯烷 酮，其作用是把外植体体释放的酚类物质及氧化形成的醌类物质吸附，从而达到防止外植 体褐化目的(王欢2012年)。尽管具有一定的预防褐化效果，但是对于不同月份取的芽进行 组织培养，其防止褐化效果差异较大，结果还不能令人满意，至今还未有有效预防天女木兰 芽组培褐化培养基的配方及方法。
第三、发明内容
本发明目的针对天女木兰芽组培褐化严重问题，提出一种预防天女木兰芽组培褐 化的培养基配方及方法。
本发明解决的技术问题采用如下技术方案：
在B5培养基中添加适量抗氧化剂(维生素C和谷胱甘肽)与多酚氧化酶抑制剂(苯甲酸 钠),形成有效预防天女木兰芽组培褐化配方及方法。
配方分为无菌苗培养基(初代培养)、继代培养基和生根培养基配方。
一种天女木兰无菌苗培养基配方，其特征包括如下组分:在B5培养基中添加细胞 分裂素6-苄基腺嘌呤(以下简称6-BA)0.5mg/L、生长素萘乙酸(以下简称NAA)0.3mg/L、 维生素C(以下简称Vc)300～500mg/L、谷胱甘肽(以下简称GSH)50～150mg/L、苯甲酸钠30～ 50mg/L和蔗糖30g/L，调pH5.6-5.8。
继代培养基配方,其特征包括如下组分：在培养基B5中添加细胞分裂素噻苯隆(以 下简称TDZ)0.3mg/L、NAA0.3mg/L、Vc300～500mg/L、GSH100～150mg/L、苯甲酸钠30～ 50mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH5.6～5.8。
生根培养基配方，其特征包括如下组分：在1/2B5培养基中添加NAA0.5mg/L、维生 素C300mg/L、GSH50mg/L、苯甲酸钠30mg/L、活性炭500mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调 pH5.6～5.8。
本发明的有益效果
(1)本方法采取添加抗氧化剂和多酚氧化酶抑制剂，从多条途代谢途径上预防天
女木兰芽组培褐化现象。本配方预防褐化效果显著，褐化率小于10%，预防了天女木兰 芽组培褐化率高的问题。
(2)培养基中添加两种抗氧化剂维生素C和谷胱甘肽，具有以下优点：抗氧化能力 强，对外植体释放的酚类物质具有较强保护作用;对植物生长及自然环境没有毒副作用;水 溶性好、使用方便。配方中同时添加两种抗氧化剂，其预防褐化效果优于使用单一抗氧化 剂。
(3)培养基中添加适量多酚氧化酶抑制剂苯甲酸钠，具有抑制多酚氧化酶活性强、 水溶性好、使用方便等优点，不但能抑制多酚氧化酶活性，还能起到一定程度杀菌作用，减 少培养基的杂菌污染几率。
第四、具体实施方式
实施例1
(1)取材：于四月初取一年生枝条，在室内水培8～10d，待芽萌动后，取顶芽和侧芽(长 度0.5～1.0cm)，放入洗洁精溶液中浸泡20min,流水冲洗2h,然后在超净工作台上用质量分 数为75%的乙醇对其表面消毒30s，用无菌水冲洗2～3次,然后用0.1%HgCl2处理7～8min, 用无菌水冲洗5～6次，接种。
(2)无菌苗获得(初代培养)：将经步骤(1)消毒后的芽，接种于培养基中培养，在B5 培养基中添加0.5mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、Vc300mg/L、GSH100mg/L、苯甲酸钠30mg/L和 蔗糖30g/L，pH5.6～5.8。光照时间12h，培养温度白天23±2°C，夜晚20±2°C光照强度1500 ～2000lx.培养30d,得无菌苗，褐化率小于10%。
(3)增殖培养(继代培养)：将步骤(2)得到的无菌苗接种于继代培养基中培养。培 养基配方为B5培养基添加TDZ0.3mg/L、NAA0.3mg/L、VC300mg/L、GSH100mg/L、苯甲酸 钠30mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH5.6～5.8。光照时间12h，培养温度白天23±2°C，夜 晚20±2°C，光照强度1500～2000lx.培养40～50d,获丛生芽，褐化率小于10%。
(4)生根培养:将步骤(3)获得的丛生芽分切成单芽进行生根培养，生根培养基配 方为1/2B5培养基、NAA0.5mg/L、Vc300mg/L、GSH50mg/L、苯甲酸钠30mg/L、活性炭500 mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH5.6～5.8。光照时间12h，培养温度白天23±2°C，夜晚20 ±2°C，光照强度1500～2000lx.培养40～50d生根，生根率75～80%，褐化率小于10%。
(5)炼苗移栽：将步骤(4)获得的生根试管苗的培养瓶盖打开，在培养势室内放置 3d后，用镊子将组培苗取出，洗去粘附在根部的培养基，在温室内移栽至V(苔藓)：V(蛭石) =1：1的基质中，移栽前将基质用质量分数为0.3%高锰酸钾溶液喷洒消毒。移栽后温度保 持在18～20゜C,相对湿度在85～90%,炼苗过程中逐渐增强光照强度，两周后长出新不定 根、新叶，移栽成活率85%。
实施例2
(1)取材：于五月中旬取当年生枝条，在实验室剪取顶芽和侧芽(长度0.5～1.0cm)，放 入洗洁精溶液中浸泡20min,流水冲洗2h,然后在超净工作台上用质量分数为75%的乙醇对 其表面消毒30s，用无菌水冲洗2～3次,然后用0.1%HgCl2处理7-8min,用无菌水冲洗5～6 次，接种。
(2)无菌苗获得(初代培养)：将经步骤(1)消毒后的芽，接种于培养基中培养，在B5 培养基中添加0.5mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、维生素C300mg/L、GSH100mg/L、苯甲酸钠 50mg/L和蔗糖30g/L，pH5.6-5.8。光照时间12h，培养温度白天23±2°C，夜晚20±2°C光照强 度1500～2000lx.培养30d,得无菌苗，褐化率小于10%。
(3)增殖培养(继代培养)：将步骤(2)得到的无菌苗接种于继代培养基中培养。培 养基配方为B5培养基添加TDZ0.3mg/L、NAA0.3mg/L、Vc300mg/L、GSH100mg/L、苯甲酸 钠50mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH5.6～5.8。光照时间12h，培养温度白天23±2°C，夜 晚20±2°C，光照强度1500～2000lx.培养40～50d,获丛生芽，褐化率小于10%。
(4)生根培养:将步骤(3)获得的丛生芽分切成单芽进行生根培养，生根培养基配 方为1/2B5培养基、NAA0.5mg/L、Vc300mg/L、GSH50mg/L、苯甲酸钠30mg/L、活性炭500 mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH5.6～5.8。光照时间12h，培养温度白天23±2°C，夜晚20 ±2°C，光照强度1500～2000lx.培养40～50d生根，生根率75～80%，褐化率小于10%。
(5)炼苗移栽：将步骤(4)获得的生根试管苗的培养瓶盖打开，在培养势室内放置 3d后，用镊子将组培苗取出，洗去粘附在根部的培养基，在温室内移栽至V(苔藓)：V(蛭石) =1：1的基质中，移栽前将基质用质量分数为0.3%高锰酸钾溶液喷洒消毒。移栽后温度保 持在18～20゜C,相对湿度在85～90%,炼苗过程中逐渐增强光照强度，两周后长出新不定 根、新叶，移栽成活率85%。
实施例3
(1)取材：于六月中旬取当年生枝条，在实验室剪取顶芽和侧芽(长度0.5～1.0cm)，放 入洗洁精溶液中浸泡20min,流水冲洗2h,然后在超净工作台上用质量分数为75%的乙醇对 其表面消毒30s，用无菌水冲洗2～3次,然后用0.1%HgCl2处理7～8min,用无菌水冲洗5～6 次，接种。
(2)无菌苗获得(初代培养)：将经步骤(1)消毒后的芽，接种于培养基中培养，在B5 培养基中添加0.5mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、维生素C400mg/L、GSH100mg/L、苯甲酸钠 50mg/L和蔗糖30g/L，pH5.6-5.8。光照时间12h，培养温度白天23±2°C，夜晚20±2°C光照强 度1500～2000lx.培养30d,得无菌苗，褐化率小于10%。
(3)增殖培养(继代培养):将步骤(2)得到的无菌苗接种于继代培养基中培养。培 养基配方为B5培养基添加TDZ0.3mg/L、NAA0.3mg/L、Vc400mg/L、GSH100mg/L、苯甲酸 钠50mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH5.6～5.8。光照时间12h，培养温度白天23±2°C，夜 晚20±2°C，光照强度1500～2000lx.培养40～50d,获丛生芽，褐化率小于10%。
(4)生根培养:将步骤(3)获得的丛生芽分切成单芽进行生根培养，生根培养基配 方为1/2B5培养基、NAA0.5mg/L、Vc300mg/L、GSH50mg/L、苯甲酸钠30mg/L、活性炭500 mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH5.6～5.8。光照时间12h，培养温度白天23±2°C，夜晚20 ±2°C，光照强度1500～2000lx.培养40～50d生根，生根率75～80%，褐化率小于10%。
(5)炼苗移栽：将步骤(4)获得的生根试管苗的培养瓶盖打开，在培养势室内放置 3d后，用镊子将组培苗取出，洗去粘附在根部的培养基，在温室内移栽至V(苔藓)：V(蛭石) =1：1的基质中，移栽前将基质用质量分数为0.3%高锰酸钾溶液喷洒消毒。移栽后温度保 持在18～20゜C,相对湿度在85～90%,炼苗过程中逐渐增强光照强度，两周后长出新不定 根、新叶，移栽成活率85%。
实施例4
(1)取材：于七月中旬取当年生枝条，在实验室剪取顶芽和侧芽(长度0.5～1.0cm)，放 入洗洁精溶液中浸泡20min,流水冲洗2h,然后在超净工作台上用质量分数为75%的乙醇对 其表面消毒30s，用无菌水冲洗2-3次,然后用0.1%HgCl2处理7～8min,用无菌水冲洗5～6 次，接种。
(2)无菌苗获得(初代培养)：将经步骤(1)消毒后的芽，接种于培养基中培养，在B5 培养基中添加0.5mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、Vc500mg/L、GSH150mg/L、苯甲酸钠50mg/L和 蔗糖30g/L，调pH5.6～5.8。光照时间12h，培养温度白天23±2°C，夜晚20±2°C光照强度 1500～2000lx.培养30d,得无菌苗，褐化率小于10%。
(3)增殖培养(继代培养):将步骤(2)得到的无菌苗接种于继代培养基中培养。培 养基配方为B5培养基添加TDZ0.3mg/L、NAA0.3mg/L、Vc500mg/L、GSH150mg/L、苯甲酸钠 50mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH5.6～5.8。光照时间12h，培养温度白天23±2°C，夜晚 20±2°C，光照强度1500～2000lx.培养40～50d,获丛生芽，褐化率小于10%。
(4)生根培养:将步骤(3)获得的丛生芽分切成单芽进行生根培养，生根培养基配 方为1/2B5培养基、NAA0.5mg/L、Vc300mg/L、GSH50mg/L、苯甲酸钠30mg/L、活性炭500 mg/L、蔗糖3g/L和琼脂7g/L，调pH5.6～5.8。光照时间12h，培养温度白天23±2°C，夜晚20 ±2°C，光照强度1500～2000lx.培养40～50d生根，生根率75～80%，褐化率小于10%。
(5)炼苗移栽：将步骤(4)获得的生根试管苗的培养瓶盖打开，在培养室内放置3d 后，用镊子将组培苗取出，洗去粘附在根部的培养基，在温室内移栽至V(苔藓)：V(蛭石)= 1：1的基质中，移栽前将基质用质量分数为0.3%高锰酸钾溶液喷洒消毒。移栽后温度保持 在18～20゜C,相对湿度在85～90%,炼苗过程中逐渐增强光照强度，两周后长出新不定根、 新叶，移栽成活率85%。
