采用一步水解微生物发酵得到的毛油，富集PUFAs的方法
技术领域
本发明涉及采用一步化学法水解微生物发酵得到的毛油，得到游离脂肪酸，再通过尿素包合与多级分子蒸馏富集多不饱和脂肪酸的方法。
背景技术
脂肪酸是重要的油脂化工基础原料。其中的多不饱和脂肪酸（PUFAs）对人体健康，预防疾病有着重大的作用，尤其以二十二碳六烯酸（cis-4,%207,%2010,%2013,%2016,%2019-Docosahexaenoic%20Acid，DHA）和二十碳二五烯酸（Docosapentaenoic%20acid，DPA）作用最为突出。一方面，DHA是一种对人体重要的多不饱和脂肪酸，具有健脑益智、促进神经核视觉系统发育、抗癌、抗炎、预防和治疗心血管疾病和延缓衰老等功效，在医药、食品、饲料等行业具有广阔的应用前景；另一方面，DPA具有抗癌的功效，对胃癌等多种癌症都具有预防功能，还具有抗炎功效，通过影响细胞因子或者酶的表达，降低致炎因子活性，从而在一定程度上治疗风湿性关节炎、牛皮鲜、系统性红斑狼疮等疾病。
传统的PUFA的来源主要是深海鱼油，例如中国专利CN101161819A和CN101348807A都公开了利用鱼油n-3PUFA浓缩物和甘油通过酯化反应富集DHA和EPA，上述两个专利均以鱼油为原料。但是，由于食物链的富集作用导致提取的鱼油中含有许多有毒有害物质，如二恶英（Dioxin）、毒杀芬等，人类在海洋中排放的重金属元素也会在海鱼的体内积累，大大影响了PUFAs的品质。以真菌和藻类合成的产品几乎不含EPA、无污染、环境友好、纯净、稳定性好、腥味小，不含胆固醇，在各种藻类中,甲藻纲具有高含量的PUFAs，近年来以发酵得到的藻油替代深海鱼油作为DHA和DPA的来源已成为一种发展趋势。
由发酵得到的藻油富集PUFAs，传统工艺中都是以精炼的藻油为初始原料，精油是由毛油通过脱胶、脱酸、脱色、脱溴等工段获得。例如中国专利CN104394702B，用于不断富集由微藻产生的、具有DHA乙酯的一种油的方法。藻油精炼过程，工段复杂耗时，同时会损耗高附加值的脂肪酸，因此，本发明创造性的以毛油为原料，利用一步化学法水解毛油，过程简单，时间短，同时能保护高附加值的脂肪酸，水解率极高。一方面，水解获得游离的脂肪酸，另一方面，达到了脱胶、脱酸、脱色效果，同时，通过多级分子蒸馏富集达到脱溴效果。直接以毛油为初始原料，省去了藻油的精炼工段，过程简单，成本低。
藻油的水解，富集工段中，都需要通过过滤去除部分固体以及杂质，传统工段中都是使用活性白土、活性炭以及硅藻土过滤。本发明创造性的以海泡石为过滤剂除杂，海泡石，是大自然中一种镁质硅酸盐类粘土化合物，化学式是Mg8Si12O30(OH)4(OH2)4·8H2O（SEP4H2O，8H2O），由于海泡石是具有较大比表面积以及层状多孔的由SiO2四面体与Mg-O八面体嫁接而成的三维立体特殊结构，在其表面还存在较多的酸性[SiO4]碱性[MgO6]中心，从而使海泡石具有较强的吸附性能，以此来吸附除杂，效果良好，完全可以替代传统的活性白土、活性炭和硅藻土。所选用的海泡石来源于湖南省湘潭市境内海泡石矿产。
发明内容
本发明属于脂肪酸的生物分离技术领域，本发明的目的是提供一种从微生物发酵制得的毛油中，通过一步水解法和富集方法得到高纯度的多不饱和脂肪酸方法，过程简单，成本低，并且极大的提高了产率。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
从微生物发酵制得的毛油中，分离纯化得到高纯度的多不饱和脂肪酸方法，将发酵制得的毛油通过化学法水解得到游离的脂肪酸，过程简单，成本低，水解率达到95%以上；将上述得到的脂肪酸通过尿素包合以及多级分子蒸馏富集得到高纯度的多不饱和脂肪酸。水解，富集工段中得到的反应液以海泡石为过滤剂过滤得到粗品，所选海泡石含量25%、40%、55%、75%、90%，优先75%含量。其具体操作步骤如下：
(1)水解反应：m毛油:V%20氢氧化钠-乙醇水溶液=1:5-10，搅拌速度200%20rpm/min-500%20rpm/min，反应温度40℃-80℃，冷凝回流，反应时间50%20min-120%20min，过程通氮气全部水解，氮封压0.02Mpa-0.05%20Mpa。反应结束经酸化，静置，萃取，水洗，除水，海泡石过滤及蒸发，获得游离脂肪酸。
(2)%20尿素包合：脂肪酸：尿素：乙醇=1:1-5:5-15（w：w：v），包合温度2℃-12℃，包合时间10%20h-24%20h。包合结束后经酸化，抽滤，萃取，除水，海泡石过滤，旋蒸得到PUFAs粗品。
（3）分子蒸馏富集：将步骤（2）中的粗品在分子蒸馏装置中蒸馏，一级蒸馏，蒸发器温度：50℃-85℃，冷凝面温度：30℃-50℃，真空度：2.5-4.5*10-1mbar；保留一级分子蒸馏后的重组分进行二级分子蒸馏，蒸发器温度：85℃-115℃，冷凝面温度：45℃-75℃，真空度：2.5-3.5*10-2%20mbar；保留二级分子蒸馏后的重组分进行三级分子蒸馏，蒸发器温度：115℃-140℃，冷凝面温度：55℃-90℃，真空度：2.5-3.5*10-2%20mbar，保留三级分子蒸馏后的重组分进行四级分子蒸馏，蒸发器温度：140℃-170℃，冷凝面温度：65℃-90℃，真空度：2.5-3.5*10-3%20mbar，保留四级分子蒸馏后的重组分进行五级分子蒸馏，蒸发器温度：170℃-200℃，冷凝面温度：65℃-90℃，真空度：1.5-2.5*10-3%20mbar，保留轻组分，海泡石吸附过滤，得到高纯度的多不饱和脂肪酸。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
本发明是通过一步水解法和富集得到高纯度的多不饱和脂肪酸方法，过程简单，成本低，并且极大的提高了产率。
（1）化学法水解，反应条件温和，反应时间短，工艺简单，藻油水解率达到95%以上；
（2）本发明创造性的以毛油为初始原料，省去了藻油的精炼工段，过程简单，环境友好，大大降低了原料成本；
（3）本发明创造性的以海泡石为过滤剂，充分利用了区域优势，成本低，效果良好；
（4）本发明创造性以尿素包合与多级分子蒸馏耦合富集PUFAs，明显地提高了PUFAs纯度，PUFAs含量达到95-99%。
具体实施方式
实施例1
(1)将发酵制得的毛油280%20g（DHA+DPA≥55%），氢氧化钠160%20g，1550%20mL乙醇（95%）溶液混合，搅拌速度300%20rpm/min，反应温度50℃，冷凝回流，反应时间60%20min，过程通氮气全部水解，氮封压0.03%20Mpa。反应结束，水解率达到96.1%，反应液经酸化，静置，萃取，水洗，除水，75%海泡石过滤及蒸发，获得游离脂肪酸。
(2)先将200%20g尿素与1600%20g乙醇（95%）混合后倒入圆底烧瓶中，置于%2060℃水浴锅冷凝回流反应，直至溶液澄清，取步骤（1）的游离脂肪酸100%20g加入圆底烧瓶中，通氮保护，反应20%20min，冷却至室温，置于5℃静置包合16%20h后取出。用4%20mol/L硫酸酸化水化层至酸性，置于分液漏斗中，用正己烷萃取三次，保留有机相（上相），用去离子水洗三次。加入适量无水硫酸钠静置除水，75%海泡石过滤，40℃旋蒸除去正己烷，得到多不饱和脂肪酸浓缩物。
(3)将步骤（2）粗产品进分子蒸馏装置进行分离纯化，一级蒸馏，蒸发器温度：60℃，冷凝面温度：35℃，真空度：3.0*10-1%20mbar，进样速率0.2%20kg/h；保留一级分子蒸馏的重组分进行二级分子蒸馏，蒸发器温度：90℃，冷凝面温度：50℃，真空度：2.5*10-2%20mbar，进样速率0.2%20kg/h；保留二级分子蒸馏的重组分进行三级分子蒸馏，蒸发器温度：120℃，冷凝面温度：60℃，真空度：2.5*10-2%20mbar，进样速率0.2%20kg/h；保留三级分子蒸馏的重组分进行四级分子蒸馏，蒸发器温度：140℃，冷凝面温度：70℃，真空度：3.5*10-3%20mbar，进样速率0.2kg/h；保留四级分子蒸馏的重组分进行五级分子蒸馏，蒸发器温度：190℃，冷凝面温度：80℃，真空度：1.5*10-3%20mbar，进样速率0.2%20kg/h，保留轻组分，用海泡石过滤后，离心分离，得到高纯度的多不饱和脂肪酸，甲酯化后，经气相色谱检测，得到DHA含量为84.3%，DPA含量为12.9%，结果见表一。
实施例2
（1）将发酵制得的毛油300%20g（DHA+DPA≥55%），氢氧化钠170%20g，1650%20mL乙醇（95%）溶液混合，搅拌速度300%20rpm/min，反应温度50℃，冷凝回流，反应时间70%20min，过程通氮气全部水解，氮封压0.03%20Mpa。反应结束，水解率达到97.4%，反应液经酸化，静置，萃取，水洗，除水，75%海泡石过滤及蒸发，获得游离脂肪酸。
（2）先将200%20g尿素与1600%20g乙醇（95%）混合后倒入圆底烧瓶中，置于%2060℃水浴锅冷凝回流反应，直至溶液澄清，取步骤（1）的游离脂肪酸100%20g加入圆底烧瓶中，通氮保护，反应20%20min，冷却至室温，置于4℃静置包合20%20h后取出。用4%20mol/L硫酸酸化水化层至酸性，置于分液漏斗中，用正己烷萃取三次，保留有机相（上相），用去离子水洗三次。加入适量无水硫酸钠静置除水，75%海泡石过滤，40℃旋蒸除去正己烷，得到多不饱和脂肪酸浓缩物。
（3）将步骤（2）粗产品进分子蒸馏装置进行分离纯化，一级蒸馏，蒸发器温度：65℃，冷凝面温度：35℃，真空度：2.5*10-1%20mbar，进样速率0.2%20kg/h；保留一级分子蒸馏的重组分进行二级分子蒸馏，蒸发器温度：100℃，冷凝面温度：50℃，真空度：2.5*10-2%20mbar，进样速率0.2%20kg/h；保留二级分子蒸馏的重组分进行三级分子蒸馏，蒸发器温度：125℃，冷凝面温度：60℃，真空度：2.5*10-2%20mbar，进样速率0.2%20kg/h；保留三级分子蒸馏的重组分进行四级分子蒸馏，蒸发器温度：145℃，冷凝面温度：70℃，真空度：3.5*10-3%20mbar，进样速率0.2kg/h；保留四级分子蒸馏的重组分进行五级分子蒸馏，蒸发器温度：195℃，冷凝面温度：80℃，真空度：1.5*10-3%20mbar，进样速率0.2%20kg/h，保留轻组分，用海泡石过滤后，离心分离，得到高纯度的多不饱和脂肪酸，甲酯化后，经气相色谱检测，得到DHA含量为85.6%，DPA含量为12.6%，结果见表一。
实施例3
（1）将发酵制得的毛油300%20g（DHA+DPA≥55%），氢氧化钠175g，1700%20mL乙醇（95%）溶液混合，搅拌速度300%20rpm/min，反应温度55℃，冷凝回流，反应时间75%20min，过程通氮气全部水解，氮封压0.03%20Mpa。反应结束，水解率达到98.7%，反应液经酸化，静置，萃取，水洗，除水，75%海泡石过滤及蒸发，获得游离脂肪酸。
（2）先将200%20g尿素与1600%20g乙醇（95%）混合后倒入圆底烧瓶中，置于%2060℃水浴锅冷凝回流反应，直至溶液澄清，取步骤（1）的游离脂肪酸100%20g加入圆底烧瓶中，通氮保护，反应30%20min，冷却至室温，置于4℃静置包合18%20h后取出。用4%20mol/L硫酸酸化水化层至酸性，置于分液漏斗中，用正己烷萃取三次，保留有机相（上相），用去离子水洗三次。加入适量无水硫酸钠静置除水，75%海泡石过滤，45℃旋蒸除去正己烷，得到多不饱和脂肪酸浓缩物。
（3）将步骤（2）粗产品进分子蒸馏装置进行分离纯化，一级蒸馏，蒸发器温度：70℃，冷凝面温度：40℃，真空度：2.5*10-1%20mbar，进样速率0.2%20kg/h；保留一级分子蒸馏的重组分进行二级分子蒸馏，蒸发器温度：105℃，冷凝面温度：55℃，真空度：2.5*10-2%20mbar，进样速率0.2%20kg/h；保留二级分子蒸馏的重组分进行三级分子蒸馏，蒸发器温度：125℃，冷凝面温度：65℃，真空度：2.5*10-2%20mbar，进样速率0.2%20kg/h；保留三级分子蒸馏的重组分进行四级分子蒸馏，蒸发器温度：150℃，冷凝面温度：70℃，真空度：3.5*10-3%20mbar，进样速率0.2kg/h；保留四级分子蒸馏的重组分进行五级分子蒸馏，蒸发器温度：195℃，冷凝面温度：85℃，真空度：1.5*10-3%20mbar，进样速率0.2%20kg/h，保留轻组分，用海泡石过滤后，离心分离，得到高纯度的多不饱和脂肪酸，甲酯化后，经气相色谱检测，得到DHA含量为85.9%，DPA含量为12.1%，结果见表一。
实施例4
（1）将发酵制得的毛油330%20g（DHA+DPA≥55%），氢氧化钠185g，1850%20mL乙醇（95%）溶液混合，搅拌速度300%20rpm/min，反应温度75℃，冷凝回流，反应时间90%20min，过程通氮气全部水解，氮封压0.03%20Mpa。反应结束，水解率达到99.1%，反应液经酸化，静置，萃取，水洗，除水，75%海泡石过滤及蒸发，获得游离脂肪酸。
（2）先将200%20g尿素与1600%20g乙醇（95%）混合后倒入圆底烧瓶中，置于%2060℃水浴锅冷凝回流反应，直至溶液澄清，取步骤（1）的游离脂肪酸100%20g加入圆底烧瓶中，通氮保护，反应30%20min，冷却至室温，置于4℃静置包合18%20h后取出。用4%20mol/L硫酸酸化水化层至酸性，置于分液漏斗中，用正己烷萃取三次，保留有机相（上相），用去离子水洗三次。加入适量无水硫酸钠静置除水，75%海泡石过滤，45℃旋蒸除去正己烷，得到多不饱和脂肪酸浓缩物。
（3）将步骤（2）粗产品进分子蒸馏装置进行分离纯化，一级蒸馏，蒸发器温度：75℃，冷凝面温度：40℃，真空度：2.5*10-1%20mbar，进样速率0.2%20kg/h；保留一级分子蒸馏的重组分进行二级分子蒸馏，蒸发器温度：110℃，冷凝面温度：55℃，真空度：2.5*10-2%20mbar，进样速率0.2%20kg/h；保留二级分子蒸馏的重组分进行三级分子蒸馏，蒸发器温度：130℃，冷凝面温度：65℃，真空度：2.5*10-2%20mbar，进样速率0.2%20kg/h；保留三级分子蒸馏的重组分进行四级分子蒸馏，蒸发器温度：155℃，冷凝面温度：65℃，真空度：3.0*10-3%20mbar，进样速率0.2kg/h；保留四级分子蒸馏的重组分进行五级分子蒸馏，蒸发器温度：195℃，冷凝面温度：80℃，真空度：1.5*10-3%20mbar，进样速率0.2%20kg/h，保留轻组分，用海泡石过滤后，离心分离，得到高纯度的多不饱和脂肪酸，甲酯化后，经气相色谱检测，得到DHA含量为86.8%，DPA含量为11.8%，结果见表一。
实施例5
（1）将发酵制得的毛油350%20g（DHA+DPA≥55%），氢氧化钠190g，1900%20mL乙醇（95%）溶液混合，搅拌速度300%20rpm/min，反应温度80℃，冷凝回流，反应时间120%20min，过程通氮气全部水解，氮封压0.03%20Mpa。反应结束，水解率达到99.5%，反应液经酸化，静置，萃取，水洗，除水，75%海泡石过滤及蒸发，获得游离脂肪酸。
（2）先将200%20g尿素与1600%20g乙醇（95%）混合后倒入圆底烧瓶中，置于%2060℃水浴锅冷凝回流反应，直至溶液澄清，取步骤（1）的游离脂肪酸100%20g加入圆底烧瓶中，通氮保护，反应30%20min，冷却至室温，置于4℃静置包合18%20h后取出。用4%20mol/L硫酸酸化水化层至酸性，置于分液漏斗中，用正己烷萃取三次，保留有机相（上相），用去离子水洗三次。加入适量无水硫酸钠静置除水，75%海泡石过滤，45℃旋蒸除去正己烷，得到多不饱和脂肪酸浓缩物。
（3）将步骤（2）粗产品进分子蒸馏装置进行分离纯化，一级蒸馏，蒸发器温度：85℃，冷凝面温度：45℃，真空度：2.5*10-1%20mbar，进样速率0.2%20kg/h；保留一级分子蒸馏的重组分进行二级分子蒸馏，蒸发器温度：115℃，冷凝面温度：50℃，真空度：2.5*10-2%20mbar，进样速率0.2%20kg/h；保留二级分子蒸馏的重组分进行三级分子蒸馏，蒸发器温度：140℃，冷凝面温度：60℃，真空度：2.5*10-2%20mbar，进样速率0.2%20kg/h；保留三级分子蒸馏的重组分进行四级分子蒸馏，蒸发器温度：165℃，冷凝面温度：70℃，真空度：3.0*10-3%20mbar，进样速率0.2kg/h；保留四级分子蒸馏的重组分进行五级分子蒸馏，蒸发器温度：200℃，冷凝面温度：70℃，真空度：1.5*10-3%20mbar，进样速率0.2%20kg/h，保留轻组分，用海泡石过滤后，离心分离，得到高纯度的多不饱和脂肪酸，甲酯化后，经气相色谱检测，得到DHA含量为87.1%，DPA含量为11.0%，结果见表一。
表一
