一种纳米级抑菌山茶籽精萃液的提取方法
技术领域
本发明涉及一种山茶籽精萃液的提取方法，具体涉及一种纳米级抑菌山茶籽精萃液的提取方法。
背景技术
山茶籽是一种出油率只有25～28%的油茶树的果实，榨油后形成的山茶籽粕多被丢弃。但是，山茶籽粕中还有约5～10%的油脂，还有如30～40%的茶多糖、15～20%的茶蛋白、15～17%的茶皂素等天然活性物质，若能充分利用好山茶籽粕可缓解我国茶油、蛋白饲料、天然表面活性剂、天然抗氧化剂等供不应求的局面，创造巨大的经济价值。
目前，对于山茶籽粕粉提取山茶籽原液的技术手段有水提法、有机溶剂法、稀酸稀碱提取法以及水提-醇萃法。
CN107595707A公开了一种山茶籽原液的制备方法，包括以下步骤：（1）压榨：将油茶籽压榨获得山茶籽渣；（2）浸出：将山茶籽渣通过溶剂浸提，获得去油山茶籽渣；（3）粉碎：将去油山茶籽渣粉碎，过筛，得到山茶籽粉；（4）热萃：将山茶籽粉和去离子水按照比例混合，加热搅拌后，添加吸附剂，持续加热搅拌，过滤得滤液；（5）精制：将滤液添加助滤剂，通过过滤机过滤，获得澄清山茶籽原液。CN107496275A公开了一种山茶籽洗洁原液及其制备方法，相对于CN107595707A，将步骤（4）替换为冷萃（超声离心），并增加一步层析（洗洁原液pH值调节为2～4再过滤），然后再将洗洁原液pH值调节为5～6。但是，两个方法都提出水提物存在过敏现象，但并未深入用3W原则进行探讨是什么原因或物质导致过敏现象；而实际上该方法用叶片式过滤器进行最终过滤，而该设备的过滤网一般为1～600目，按照1目=5/9μm计算，过滤后的原液仍然会有大量微小粕粉颗粒，由此判断其过敏现象可能与粕粉微粒有关。
陈海燕公开了油茶籽粕抑菌活性物分离纯化与活性研究，是通过将乙醇浓度、提取温度、固液比、提取温度进行正交试验，主要就茶皂素提取的活性稳定性，以抑菌试验中的抑菌圈大小作为一个指标，对金葡、大肠、黑曲霉等菌进行抑菌测试，讨论茶皂素活性对抑菌的效果，但缺少对茶多糖、茶蛋白的活性及产率的研究（陈海燕，油茶籽粕抑菌活性物分离纯化与活性研究，华南农业大学，硕士论文，2012年）。
目前，对茶籽饼粕中提取茶皂素后，进行纯化，再对纯化后的茶皂素进行研究，一部分对提取工艺进行优化的目的是为了提高茶皂素的含量及得率；一部分对纯化后的茶皂素进行抑菌方面的研究。但两者都仅仅停留在实验室的正交试验阶段，只是对工业生产起到指导作用，并无工业生产可行性方面的研究。
综上，亟待找到一种所得精粹液茶皂素、茶多糖和茶蛋白含量、收率高，且外观澄清透亮，抑菌效果好，保质期长，稳定性好，无添加剂，绿色安全，工艺简单连续且低耗高效，适宜于工业化生产的纳米级抑菌山茶籽精萃液的提取方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种所得精粹液茶皂素、茶多糖和茶蛋白含量、收率高，且外观澄清透亮，抑菌效果好，保质期长，稳定性好，无添加剂，绿色安全，工艺简单连续且低耗高效，适宜于工业化生产的纳米级抑菌山茶籽精萃液的提取方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种纳米级抑菌山茶籽精萃液的提取方法，包括以下步骤：
（1）将山茶籽粕粉碎，过筛，得山茶籽粕粉，在山茶籽粕粉中加入有机溶剂，再加水，超声后，加热搅拌，得山茶籽粕微乳液；
（2）将步骤（1）所得山茶籽粕微乳液进行超声破乳，离心，静置后，油水相分层，提取水相，在水相中加入吸附剂，搅拌，过滤，滤液经纳滤，得纳米级抑菌山茶籽精萃液。
优选地，步骤（1）中，所述山茶籽粕中，茶皂素的质量含量为15～17%，茶多糖的质量含量为30～40%，茶蛋白的质量含量为15～20%，山茶籽油的质量含量为5～10%。
优选地，步骤（1）中，所述过筛至粒度为30～100目。若粒度过大，则会形成滤饼层，增加后续过滤难度，若粒度过小，则提取不充分，产率低。
优选地，步骤（1）中，所述山茶籽粕粉与有机溶剂和水的质量比为1:0.1～0.3:5～10。若有机溶剂和水的用量过低，则渗透不够，精萃液得率低，若有机溶剂和水的用量过高，则能耗高，效率低。
优选地，步骤（1）中，所述有机溶剂为含2～6个碳原子的低碳醇。低碳醇具有双亲基团（C4OH），可形成水-油-皂素的长链，可同时将水中的水溶性成分和油中的油溶性成分都提取出来。
优选地，所述低碳醇为正己醇和/或正丁醇。正己醇或正丁醇与水复合后会形成双亲溶剂，即同时具有亲油性和亲水性，从而实现同步微乳萃取，且由于其沸点不高，易于挥发回收。
优选地，所述低碳醇为正己醇和正丁醇的质量比为1～3:1的复配醇。
优选地，步骤（1）中，所述超声的频率为20～30kHz，时间为10～20min。本步骤进行超声的目的是超声破壁，打开细胞壁，从而更有利于释放目标成分。
优选地，步骤（1）中，所述加热搅拌的温度为30～60℃，搅拌的速度为200～400r/min，时间为40～80min。经过加热搅拌可使得破壁后的山茶籽粕能与水和有机溶剂充分混合、渗透。
优选地，步骤（2）中，所述超声破乳的频率为20～50kHz，时间为10～30min。本步骤进行超声的目的是破乳，破乳后更有利于油水相分层。
优选地，步骤（2）中，所述离心的转速为1000～2000r/min，时间为10～20min。
优选地，步骤（2）中，所述静置的温度为20～30℃，时间为60～120min。静置分层后油相中主要含有维生素E，磷脂，油脂，水相中主要含有茶皂素、茶多糖、茶蛋白。
优选地，步骤（2）中，所述吸附剂与水相的质量体积比（kg/L）为0.5～6.0:100。吸附剂的作用主要是吸附胶质、可溶性盐类等。若吸附剂用量过少，则澄清度较低，若吸附剂用量过多，则吸附效果不但没有增加，反而造成浪费。
优选地，步骤（2）中，所述吸附剂为甲壳素和/或甲基纤维素。甲壳素的吸附作用主要表现在两个方面：一是多孔吸附，溶质分子能自由进入甲壳素的孔径内而被截留，从而起到澄清效果；二是表面吸附，有机化合物能与甲壳素表面的羟基结合形成稳定的氢键；由于甲壳素表面凹凸不平显著，吸附效果好，特别是对金属离子的吸收会降低茶多糖与金属离子的络合修饰，增强活性，且甲壳素可以重复利用3～4次。而在复配吸附剂低浓度时，甲基纤维素可吸附到茶白质的外围形成次级保护层，增加了水相体系的稳定性。
优选地，步骤（2）中，所述吸附剂为甲壳素和甲基纤维素的质量比为1:1～5的混合物。所述比例搭配既能保证吸附效果及效率，又能最大程度的增加溶液中的茶多糖、茶皂素、茶蛋白的活性。
优选地，步骤（2）中，所述搅拌的速度为40～80r/min，时间为10～20min。
优选地，步骤（2）中，所述过滤采用双联布袋式过滤器。
优选地，步骤（2）中，所述纳滤所用纳滤膜的截留分子量为100～300kDa。纳滤的作用是进一步去除溶液中微小的茶籽粕粉。
优选地，步骤（2）中，将油相真空精制，冷冻，得山茶籽油。油相可通过真空多段精制将正丁醇或正己醇蒸发冷凝，得到纯度99.9%以上的可食用山茶籽油。
优选地，所述真空精制的温度为100～120℃，真空度为0.6～2.0kPa。
优选地，所述冷冻的温度为5～-2℃，采用分段程序控温，时间为24～48h。
本发明方法采用香草醇-浓硫酸比色法检测茶皂素，苯酚-硫酸法检测茶多糖，BAC试剂法检测茶蛋白，GB/T 11765检测山茶籽油。
本发明方法的有益效果如下：
（1）本发明方法通过对茶籽粕进行同步微乳化萃取，能同时对茶油和茶籽提取物进行同步提取，且茶籽提取液中的活性物质含量高，收率高，茶皂素、茶多糖和茶蛋白的干基总质量含量≥97.7%，茶皂素的收率高达95.6%，茶多糖的收率高达92.8%，茶蛋白的收率高达94.7%，且外观澄清透亮，可用于日化原料的添加和使用；
（2）本发明方法所得抑菌山茶籽精萃液抑菌效果好，无需添加额外防腐制剂，pH值控制在6～8之间，能起到很好的防腐效果，保质期长，稳定性好，绿色安全；通过真空精制所得山茶籽油符合GB/T 11765一级质量指标；
（3）本发明方法工艺简单连续且低耗高效，将实验室研究的成果转化成工业化生产，从批次生产的结果导向来反向论述同步微乳萃取的高效性以及活性成分的含量、收率，适宜于工业化生产。
附图说明
图1是紫外-可见分光光度计在190～900nm波长对纳米级抑菌山茶籽精萃液1的全波长扫描图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的山茶籽粕购于湖南金霞（浏阳）油茶科技有限公司，茶皂素的质量含量为16.4%，茶多糖的质量含量为37%，茶蛋白的质量含量为19%，山茶籽油的质量含量为8%；本发明实施例所使用的截留分子量100kDA、200kDA的纳滤膜购于上海必泰；本发明实施例所使用的原料或食品添加剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
本发明方法采用香草醇-浓硫酸比色法检测茶皂素，苯酚-硫酸法检测茶多糖，BAC试剂法检测茶蛋白，GB/T 11765检测山茶籽油。
实施例1
（1）将山茶籽粕粉碎，过筛至粒度为30～50目，得山茶籽粕粉，在28kg山茶籽粕粉中加入5.6kg复配醇（正己醇和正丁醇的质量比为2:1），再加196kg水，在25kHz下，超声15min后，在45℃、300r/min下，加热搅拌60min，得山茶籽粕微乳液；
（2）将步骤（1）所得山茶籽粕微乳液在40kHz下，进行超声破乳20min，在1500r/min下，离心15min，在23℃下，静置90min后，油水相分层，提取水相196L，在196L水相中加入3kg吸附剂（甲壳素1kg、甲基纤维素2kg），在60r/min下，搅拌15min，再用双联布袋式过滤器过滤，滤液经截留分子量为100kDA的纳滤膜纳滤，得167kg纳米级抑菌山茶籽精萃液1（干基质量19.15 kg）。
步骤（2）中，将9.3L油相在110℃、1.0kPa下，真空精制，再于5～0℃下，采用分段程序控温，冷冻36h，得2.101kg山茶籽油。
经检测，本发明实施例所得纳米级抑菌山茶籽精萃液1中，茶皂素的质量含量为2.63%（干基含量22.94%）、收率为95.6%，茶多糖的质量含量为5.66%（干基含量49.36%）、收率为91.2%，茶蛋白的质量含量为2.98%（干基含量25.99%）、收率为93.5%，茶皂素、茶多糖和茶蛋白的干基总质量含量为98.28%；山茶籽油的质量含量为99.99%、收率为93.79%，符合GB/T 11765一级山茶籽油质量指标。
实施例2
（1）将山茶籽粕粉碎，过筛至粒度为70～100目，得山茶籽粕粉，在18kg山茶籽粕粉中加入5.4kg复配醇（正己醇和正丁醇的质量比为3:1），再加90kg水，在20kHz下，超声10min后，在30℃、200r/min下，加热搅拌40min，得山茶籽粕微乳液；
（2）将步骤（1）所得山茶籽粕微乳液在30kHz下，进行超声破乳10min，在1000r/min下，离心10min，在20℃下，静置60min后，油水相分层，提取水相90L，在90L水相中加入3kg吸附剂（甲壳素0.6kg、甲基纤维素2.4kg），在40r/min下，搅拌10min，再用双联布袋式过滤器过滤，滤液经截留分子量为100kDA的纳滤膜纳滤，得86kg纳米级抑菌山茶籽精萃液2（干基质量12.31kg）。
步骤（2）中，将8.2L油相在105℃、1.2kPa下，真空精制，再于2～-2℃下，采用分段程序控温，冷冻24h，得1.321kg山茶籽油。
经检测，本发明实施例所得纳米级抑菌山茶籽精萃液2中，茶皂素的质量含量为3.25%（干基含量22.71%）、收率为94.7%，茶多糖的质量含量为7.09%（干基含量49.53%）、收率为91.6%，茶蛋白的质量含量为3.66%（干基含量25.57%）、收率为92.0%，茶皂素、茶多糖和茶蛋白的干基总质量含量为97.81%；山茶籽油的质量含量为99.96%、收率为91.7%，符合GB/T 11765一级山茶籽油质量指标。
实施例3
（1）将山茶籽粕粉碎，过筛至粒度为50～70目，得山茶籽粕粉，在28kg山茶籽粕粉中加入2.8kg复配醇（正己醇和正丁醇的质量比为1:1），再加196kg水，在30kHz下，超声20min后，在60℃、400r/min下，加热搅拌80min，得山茶籽粕微乳液；
（2）将步骤（1）所得山茶籽粕微乳液在20kHz下，进行超声破乳30min，在2000r/min下，离心20min，在28℃下，静置120min后，油水相分层，提取水相196L，在196L水相中加入2kg吸附剂（甲壳素1.0kg、甲基纤维素1.0kg），在80r/min下，搅拌20min，再用双联布袋式过滤器过滤，滤液经截留分子量为200kDA的纳滤膜纳滤，得156kg纳米级抑菌山茶籽精萃液3（干基质量19.38kg）。
步骤（2）中，将6.1L油相在110℃、1.6kPa下，真空精制，再于3～-1℃下，采用分段程序控温，冷冻48h，得2.050kg山茶籽油。
经检测，本发明实施例所得纳米级抑菌山茶籽精萃液3中，茶皂素的质量含量为2.75%（干基含量22.14%）、收率为93.4%，茶多糖的质量含量为6.16%（干基含量49.59%）、收率为92.8%，茶蛋白的质量含量为3.23%（干基含量26.00%）、收率为94.7%，茶皂素、茶多糖和茶蛋白的干基总质量含量为97.72%；山茶籽油的质量含量为99.98%、收率为91.5%，符合GB/T 11765一级质量指标。
为了进一步评价本发明方法所得纳米级抑菌山茶籽精萃液的性能，对实施例1所得纳米级抑菌山茶籽精萃液1进行以下性能测试。
（1）澄清度试验：
利用紫外-可见分光光度计在190～900nm波长对纳米级抑菌山茶籽精萃液1进行全波长扫描（如图1所示），确定其最大吸收峰时波长为550nm。
将纳米级抑菌山茶籽精萃液1稀释不同比例后，在550nm波长处进行吸光度和透光率的测试，结果如表1所示。
表1 纳米级抑菌山茶籽精萃液1在不同稀释比下550nm波长处的吸光度和透光率表
由表1可知，随着纳米级抑菌山茶籽精萃液稀释比例的增加，透光率上升，吸光度下降，说明本发明实施例1所得纳米级抑菌山茶籽精萃液澄清透明程度为肉眼可见。
（2）稳定性试验：
将纳米级抑菌山茶籽精萃液1在不同离心转速下，观察其分层、杂质及溶液状态，结果如表2所示。
表2 纳米级抑菌山茶籽精萃液1在不同离心转速下的分层、杂质及溶液状态表
将经过离心试验后的溶液进行比色测试，所得比色结果均为红8.5，黄18.4。
由表2可知，本发明实施例1所得纳米级抑菌山茶籽精萃液1即使经过高速离心后，依然澄清透明，说明其性质十分稳定。
（3）保质期试验：
将纳米级抑菌山茶籽精萃液1（原液pH值为6.5）取5瓶500mL，置于42℃的恒温恒湿试验箱中60天，每10天或15天随机取出一瓶纳米级抑菌山茶籽精萃液，观察其颜色、闻味道，测量pH值，计算其稳定时间（如表3所示），并按照检测标准《化妆品安全技术规范2015年版 第五章 微生物检验方法》测试60天后的微生物情况（如表4所示）。
表3 纳米级抑菌山茶籽精萃液1在对应抽查时间下的稳定时间表
注：表中，稳定性时间的热力学计算公式为：t=t0*4[(T-18)/10]。
表4 纳米级抑菌山茶籽精萃液1恒温恒湿60天后的微生物情况测试报告表
纳米级抑菌山茶籽精萃液1在42℃下恒温恒湿放置60天后，放置前后颜色和味道均无明显变化，pH值为6.4，由表4可知，微生物菌落无检出；由表3、4可知，本发明实施例1所得纳米级抑菌山茶籽精萃液1的保质期计算结果可以达到4.6年，远超化妆品3年的保质期。
（4）抑菌试验：
将市售山茶籽萃取液（1#）与纳米级抑菌山茶籽精萃液1（2#）分别用移液枪移取100μL滴到准备好的纯化菌种培养基中，对5种人体致病菌：白色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌效果如表5所示。
表5 市售山茶籽萃取液与纳米级抑菌山茶籽精萃液1对5种人体致病菌的抑菌效果表
由表5可知，本发明实施例1所得纳米级抑菌山茶籽精萃液1相对于市售山茶籽萃取液对白色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌具有更好的抑菌效果。
