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一种产耐高温蛋白酶菌株

2021-02-05 10:01:20

一种产耐高温蛋白酶菌株

　　技术领域

　　本发明属于微生物领域，具体涉及一种产耐高温蛋白酶菌株。

　　背景技术

　　蛋白酶是能水解蛋白质的一种生物催化剂，该酶催化的反应具有速度快、条件温和、环保无污染而被广泛应用于制革、食品、医药卫生及化妆品等行业。蛋白酶在制革工艺中被用于原料皮残肉、胶原间隙蛋白和类粘蛋白的去除，使处理后的皮革柔软(胡学智，王俊，2008)；在食品工业上主要被用来嫩化肉类、水解蛋白质制备调味液、制作干酪等(胡学智，王俊，2008)。在医药卫生领域，中性蛋白酶被用于水解藏羊血清蛋白来制备抗氧化肽(高丹丹，等，2015)，也可被用于制备抗癌药物中间体(Teodora bavaro,Terreni,2016)等。此外，中性蛋白酶还可被用于化妆品研发中，用来除老化角质(张晓燕，国立东，刘晓艳，2018)。因此，研发新蛋白酶具有重要应用价值。

　　蛋白酶存在于动物组织、植物茎叶、果实及各种微生物中。受动植物资源的限制，目前工业上广泛用于生产的蛋白酶制剂主要来源于微生物；其中所用菌株主要为细菌、霉菌、少量酵母菌和放线菌。已有研究表明，细菌中产蛋白酶的菌株主要集中在枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)、短芽孢菌属(Brevibacillus)和盐单胞菌属(Halomonas)。蛋白酶按最适反应pH值可分为酸性(pH值2.0～6.0)、中性(pH值6.0～9.0)和碱性蛋白酶(pH值9.0以上)三大类，其中中性蛋白酶研究最早、研究较为清楚；然而，目前还鲜有文献报道中性蛋白酶能耐受60℃及以上高温。

　　发明内容

　　针对现有技术存在的问题，本发明提供一种产耐高温蛋白酶菌株。

　　本发明为实现上述目的所采用的技术方案为：

　　一种产耐高温蛋白酶菌株，所述菌株为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)，于2019年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌株保藏编号为：CCTCC M 2019836。

　　进一步的，所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

　　本发明还提供一种蛋白酶制备方法，将所述的菌株用种子活化培养基活化12h；再将活化后的菌种接种至发酵培养基中，置于28℃、180rpm摇床中恒温发酵5d；吸取发酵后培养液离心并吸取上清液。

　　本发明还提供一种蛋白酶，所述蛋白酶的使用条件为pH6.0～8.0，温度50～70℃。

　　本发明还提供一种发酵制品，包括所述产耐高温蛋白酶菌株的发酵液或发酵液的过滤液。

　　本发明还提供所述菌株在生产去污剂中的应用。

　　本发明还提供一种去污剂，包括所述的发酵制品和5.0％去污剂吐温80。

　　进一步的，所述去污剂中含有Ca2+。

　　本发明还提供一种产耐高温蛋白酶的菌剂，所述菌剂包含所述的菌株。

　　有益效果：

　　我国酶制剂行业经过近60年的发展，已迈入酶制剂生产大国的行列，规模化生产的酶制剂有30余种，但与世界已有60余种规模化生产还有一定差距。目前，我国的酶制剂主要包含糖化酶、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等9大类；而蛋白酶的最大用户是洗涤剂工业。欧洲使用加酶洗衣粉的比列高达85％，且欧洲人习惯于在洗衣前先用40～60℃热水浸泡。本研究中菌株HSU-2产的蛋白酶可耐受60℃高温，且该蛋白酶能耐受5.0％SDS的作用，适合研发用于欧洲地区使用的加酶洗衣粉，以提升其工业价值。

　　本发明利用酪素培养基筛选法筛选出一株产蛋白酶B.cereus菌株HSU-2，其产蛋白酶的最适反应pH值和温度分别是7.0和60℃，是一种耐高温的中性蛋白酶。该蛋白酶可耐受5.0％过氧化氢、5.0％十二烷基磺酸钠和5.0％去污剂Triton X-100作用，而5.0％去污剂吐温80可显著提高该蛋白酶的酶活力。同时，金属离子对该蛋白酶酶活力影响的结果表明，Mg2+、Zn2+、K+、Ni2+和Cu2+5种金属离子可显著降低该蛋白酶酶活力，其中Zn2+抑制作用最强；而Ca2+离子可提高该蛋白酶酶活力。本发明为产蛋白酶菌株HSU-2的工业化应用和大规模生产奠定了理论基础。

　　附图说明

　　图1为菌株HSU-2的菌落；

　　图2为基于16S rDNA序列比对结果构建菌株HSU-2的分子进化树；

　　图3为酪蛋白标准曲线；

　　图4为pH值对酶活力的影响；

　　图5为温度对酶活力的影响；

　　图6为过氧化氢对酶活力的影响；

　　图7为去污剂(A)十二烷基磺酸钠、(B)聚乙二醇辛基苯基醚X-100和(C)吐温80对酶活力的影响；

　　图8为金属离子对酶活力的影响。

　　具体实施方式

　　下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

　　土壤样品：本实验用的土壤采自黄山学院校园内树林下，距离表层土壤约5cm处；用采样铲挖开表层土壤后，取出根际土壤放入已灭菌的锥形瓶中，带回实验室备用。

　　实验仪器：超净工作台(ZHJH-C2109B，上海智城)、恒温培养箱(MQD-B2R，上海旻泉)、高压灭菌锅(SQ510C，重庆雅马拓)、培养箱(ZGP-2050，上海智城)、三孔恒温电热水槽(DK-8D，上海匡贝实业)、紫外可见分光光度计(UV-765，上海精密科学仪器)、离心机(AvantiJ-E，美国贝克库尔特公司)。

　　试剂：Trypticase、干酪素、蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、淀粉、甲基红、草酸铵结晶紫、番红和碘液、过氧化氢(H2O2)、十二烷基磺酸钠(SDS)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、吐温80(Tween 80)等购于上海生工公司；NaCl、ZnCl2、Na2HPO4·7H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4、KH2PO4、甘油和95％乙醇等购于上海国药集团。

　　酪素培养基配制方法如下，其具体浓度如下：KH2PO4(3.6％)、MgSO4·7H2O(5％)、ZnCl2(0.14％)、Na2HPO4·7H2O(10.7％)、NaCl(1.6％)、CaCl2(0.02％)、FeSO4(0.02％)、酪素(4％)(称取4g干酪素置于50mL烧杯中，用移液枪准确移取8mL1 mol/L NaOH加入其中，水浴加热20min，待所有固体完全溶解后放容量瓶定容至100mL，即得到所需目标溶液)、Trypticase(0.5％)。

　　1.试验方法

　　1.1产蛋白酶菌株的分离与纯化

　　称取1.0g已采集的土壤加入到含有活化培养基的锥形瓶中，摇匀后置于80℃水浴锅中保温10min；然后将其放置在28℃、180r/min振荡培养箱中恒温培养24h。剩余的土样密封保存，备用。将培养24h后的培养液再次置于80℃水浴锅中保温10min，采用十倍稀释法将上述增殖后培养液依次稀释至10-3、10-4和10-5，分别移取100μL该稀释液涂布于酪素固体培养基上，并置于28℃恒温箱中培养24h。观察酪素固体培养基上菌落周围的透明水解圈，测量透明圈直径(H)和菌落直径(C)，选取比值(H/C)大的菌落进行纯化；利用划线法对上述菌落进行多次纯化，直至纯化出单菌落，且菌落特征稳定。对纯化后的H/C比值大菌落进行编号，并保存备用。

　　1.2产蛋白酶菌株的鉴定

　　取纯化后H/C比值最大的菌株HSU-2进行菌落形态特征观察，提取菌株HSU-2的基因组DNA，并利用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′对该菌株的16S rDNA序列进行扩增和测定。将测序获得的16SrDNA序列放入NCBI数据库中做比对，选择序列一致性在99.43％以上的菌株序列，利用序列比对软件Clustal X 2.1和进化分析软件MEGA 6.06(Tamura,et al,2013)构建分子进化树，鉴定菌株HSU-2的种类。

　　1.3酪蛋白标准曲线的绘制

　　配制酪蛋白标准溶液，并测定溶液在280nm处的吸光值，重复3次。根据实验结果绘制酪蛋白标准曲线。

　　1.4菌株HSU-2发酵及蛋白酶提取

　　从-80℃冰箱中取出保存的菌株HSU-2，用种子活化培养基活化12h；再将活化后的菌种接种至发酵培养基中，置于28℃、180rpm摇床中恒温发酵5d。吸取发酵后培养液，于离心机中8000rpm离心5min；小心吸取上清液，即为粗酶液。

　　1.5蛋白酶的最佳反应pH值

　　测定蛋白酶的最佳反应pH值，简述如下：分别配制pH值为4、5、6、7、8和9的反应缓冲液，分别取3.5mL上述6种pH缓冲液，加入10mg/mL酪蛋白溶液0.5mL，再加入1mL步骤1.2.4中获得的粗酶液，混合均匀后将反应液置于37℃水浴锅中恒温反应20min。取出反应液，加入1mL 20％(w/v)三氯乙酸(TCA)充分混匀，终止反应。在加入酪蛋白前，先用TCA将粗酶液失活，作为对照组。将TCA终止反应后的反应液配平，并于12000rpm离心5min，小心吸取上清液于280nm处测量其吸光值，每组实验重复三次，取其平均值进行分析。

　　1.6蛋白酶的最佳反应温度

　　在步骤1.2.5确定的最佳反应pH值下，参照步骤1.2.5的方法测定该蛋白酶的最佳反应温度，方法简述如下：配制pH为7.0的缓冲液，取52.5mL该缓冲液加至250mL烧杯中，再分别向该缓冲液中依次加入10mg/mL酪蛋白溶液7.5mL，15mL步骤1.2.4中获得的粗酶液，混合均匀后分装为5mL每试管。分别将这些试管放置于30、40、50、60和70℃恒温水浴锅中反应20min后，依次加入1mL 20％TCA终止反应；配平后12000rpm离心5min，吸取上清液于280nm处测量其吸光值，重复三次，取平均值进行分析。

　　1.7过氧化氢对蛋白酶酶活力的影响

　　在步骤1.2.5和步骤1.2.6确定的最佳反应pH和温度下，测试添加不同浓度H2O2及不同处理时间对蛋白酶酶活力的影响，方法如下：分别在pH 7.0的缓冲液中加入浓度分别为1％、5％和10％(v/v)的H2O2并定容至3.5mL，加入1mL步骤1.2.4中提取的粗酶液，混匀后将溶液置于冰上分别处理20、40和60min；然后分别加入10mg/mL酪蛋白溶液0.5mL，混匀后将反应液置于60℃水浴中反应20min，加入1mL 20％TCA终止反应；配平后12000rpm离心5min，吸取上清液于280nm处测量其吸光值，重复三次。同时，以不加H2O2处理的粗酶液做对照，按以上步骤测定其酶活力并将其设为100％，比较H2O2处理对该蛋白酶酶活力的影响。

　　1.8去污剂对蛋白酶酶活力的影响

　　按步骤1.2.7方法测试不同去污剂、不同浓度及不同处理时间对蛋白酶酶活力的影响，简述如下：在pH 7.0的缓冲液中加入浓度分别为0.5％、1.0％、2.5％和5.0％(w/v)的SDS、Triton X-100或Tween 80并定容至3.5mL，加入1mL步骤1.2.4中提取的粗酶液，混匀后将溶液置于冰上分别处理20、40和60min；按步骤1.2.7比较去污剂对该蛋白酶酶活力的影响。

　　1.9金属离子对蛋白酶酶活力的影响

　　按步骤1.2.7方法测定加入1mM的金属离子Mg2+、Zn2+、K+、Ni2+等处理5min后的酶活力，比较金属离子对该蛋白酶酶活力的影响。

　　2.结果与分析

　　2.1菌株HSU-2的分子鉴定

　　采用透明圈法从校园内土壤中筛选到一株产耐高温蛋白酶的菌株HSU-2(图1)。从图1中可知，该菌株在酪素筛选固体培养基上形成明显的透明水解圈，且透明圈直径(H)与菌落直径(C)的比值约为4.1。该菌株在酪素固体培养基上形成的菌落呈圆形且较干燥，菌落中间微白、四周微黄。部分生理生化指标检测发现该菌株的淀粉水解实验、接触酶实验、甲基红实验均为阳性，该菌生长过程不需要NaCl或仅能在1％浓度的NaCl培养基上生长(表1)，而浓度为5％或10％的NaCl则会抑制该菌株的生长。

　　表1菌株HSU-2的生理生化实验结果

　　利用通用引物27F和1492R扩增菌株HSU-2的16S rDNA序列用于测序分析，结果显示菌株HSU-2的16S rDNA序列约为1407bp。将测序获得的序列放入NCBI数据库中用BLAST工具进行同源性分析，比对结果显示，与菌株HSU-2序列同源性较高的菌株来源于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。从比对结果中选择与菌株HSU-2序列一致性均为99.43％以上的菌株序列，利用软件ClustalX 2.1进行多序列比对，同时参照柏晓辉等(2018)报道的方法构建分子进化树(图2)。从构建的进化树结果可知，菌株HSU-2与Bacillus cereus strain JCM2152等5株蜡样芽孢杆菌位于相同的进化树分支上。结合以上菌株的菌落、部分生理生化特征及16S rDNA进化分析结果，将菌株HSU-2鉴定为蜡样芽孢杆菌HSU-2(Bacillus cereusstrain HSU-2)。

　　2.2酪蛋白标准曲线的绘制

　　分别测定不同酪蛋白浓度下的吸光值，绘制标准曲线(图3)。从测定结果可知，酪蛋白溶液的吸光值与其浓度正相关，且呈增加的趋势。酪蛋白溶液浓度(X)与其吸光值(Y)的回归方程为：Y＝1.1647X+0.0061(R2＝0.9998)，该标准曲线的线性相关性非常好，可用于酶活力的测定。

　　2.3pH值对蛋白酶酶活力的影响

　　用一系列pH值分别为4、5、6、7、8和9的缓冲液做反应液，测试pH对菌株HSU-2产蛋白酶活力的影响(图4)。从实验结果可知，菌株HSU-2产蛋白酶在酸性(pH<5)条件下活力较低；当反应液pH值自5升高至7时，其酶活力显著升高，并在pH 7时达到最大值；而当pH值继续升高至偏碱性(pH值8～9)条件时，该蛋白酶活力受到影响有所降低；与偏酸性条件相比，该蛋白酶在偏碱性条件仍可维持在较高水平。以上结果表明，菌株HSU-2产蛋白酶的最佳反应pH值为7，且在一定范围内具有耐碱性。

　　2.4温度对蛋白酶酶活力的影响

　　在上述实验测定的菌株HSU-2产蛋白酶最佳反应pH值为7条件下，测定不同温度(分别为30、40、50、60和70℃)对该蛋白酶酶活力的影响(图5)。实验结果表明，该蛋白酶在温度为60℃前，酶活力随着温度的升高而升高，且在温度为60℃时酶活力最大；当温度继续升高，酶活力开始下降。因此，菌株HSU-2产蛋白酶最佳反应温度为60℃。

　　2.5其他因素对蛋白酶酶活力的影响

　　2.5.1过氧化氢对蛋白酶酶活力的影响

　　以pH 7.0、反应温度为60℃时的蛋白酶活力为100％，检测不同浓度过氧化氢(H2O2)对菌株HSU-2产蛋白酶活力的影响，结果如图6。实验结果表明，浓度为1％的H2O2可提高菌株HSU-2产蛋白酶的酶活力，而浓度为5％或10％的H2O2可降低菌株HSU-2产蛋白酶的酶活力。同时，随着H2O2处理时间的延长，浓度为1％、5％和10％的H2O2皆会不同程度降低菌株HSU-2产蛋白酶的酶活力。

　　2.5.2三种去污剂对蛋白酶酶活力的影响

　　以pH 7.0、反应温度为60℃时的蛋白酶活力为100％，检测3种不同种类及浓度的去污剂对菌株HSU-2产蛋白酶活力的影响，结果如图7。从图7A结果可知，当去污剂十二烷基磺酸钠(SDS)浓度分别为0.5、1.0和2.5％时，处理该蛋白酶20min对其酶活力没有显著影响；且随着处理时间延长至40、60min，这3种浓度的SDS仍对该蛋白酶的酶活力没有显著影响。而当SDS浓度升高至5.0％，处理不同时间后使得该蛋白酶的酶活力略有降低，但酶活力仍维持在95％以上。

　　图7B实验结果表明，去污剂Triton X-100浓度分别为0.5、1.0和5.0％时，其可略微提高菌株HSU-2产蛋白酶的酶活力；且随着处理时间的延长至40、60min后，该蛋白酶的酶活力均可维持在100％以上。

　　由图7C的结果可知，当使用浓度分别为0.5、1.0和5.0％的去污剂Tween 80处理该蛋白酶20min后，该蛋白酶的酶活力可被提高至115.8％～122.7％；处理40min后，该蛋白酶的酶活力被提高至123.3％～133.6％；处理60min后，该蛋白酶的酶活力仍可维持在119.6％～126.6％。

　　2.5.3金属离子对蛋白酶酶活力的影响

　　以pH 7.0、反应温度为60℃时的蛋白酶活力为100％，检测终浓度为1mM的金属离子Mg2+、Zn2+、K+、Ni2+等对该蛋白酶酶活力的影响(图8)。实验结果表明，Mg2+、Zn2+、K+、Ni2+和Cu2+5种金属离子可显著降低该蛋白酶的酶活力，其中Zn2+抑制作用最强，酶活力降低至仅为34.0％；Ni2+和Cu2+抑制作用次之，酶活力分别降至50.5％和45.2％；Mg2+和K+抑制作用较弱，酶活力分别降至85.8％和81.0％。相反，Ca2+离子可提高该蛋白酶的酶活力至116.5％。

　　序列表

　　<110> 黄山学院

　　<120> 一种产耐高温蛋白酶菌株

　　<160> 1

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 1407

　　<212> DNA

　　<213> 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)

　　<400> 1

　　tgcagtcgag cgaatggatt aagagcttgc tcttatgaag ttagcggcgg acgggtgagt 60

　　aacacgtggg taacctgccc ataagactgg gataactccg ggaaaccggg gctaataccg 120