一种从蒜头果油中分离神经酸的方法及应用
技术领域
本发明属于生物化学领域，更具体地说是涉及一种从蒜头果油中分离神经酸的方法及应用。
背景技术
蒜头果(Malania%20oleifera%20Chun%20et%20Lee)是铁青树科(Olacaceae)，马兰木属(Malania)唯一的单种属植物，又称马兰木或云南铁青树，为我国特有的孑遗物种，属于国家二级重点保护植物，主要分布于云南东南部文山州的广南、富宁和广西西部与云南接壤的局部地区，为我国特有的单种属孑遗树种，因分布范围与种群数量十分有限，2010年被国家列为云南省20个极小种群之一。
蒜头果种子含有丰富的油脂，含量高达50％-55％。其中，在蒜头果油中二十四碳-15-烯酸，(也称为神经酸)所占脂肪酸比例高达40％-50％。神经酸是一种不饱和脂肪酸，对人体的益处很多，它可以使神经末稍活性恢复甚至增强，促机体进神经细胞组织的生长和发育，并对患有心脑血管疾病和人体自身免疫缺乏性疾病的患者有很好的疗效。
通过对蒜头果油进行GC-MS分析，发现，蒜头果油中主要含有7种脂肪酸，分别为油酸21.54％，棕榈酸1.5％，二十碳烯-11-酸7.04％，芥酸18.29％，二十二烷酸1.33％，二十四碳-15-酸40.92％，二十四烷酸2.14％，可见，蒜头果油中芥酸含量较高，大量摄入含芥酸高的食用油可致心肌纤维化引起心肌病变；引起动物增重迟缓，发育不良；生殖力下降等；这也就意味着，如果以蒜头果为原料提取神经酸，很有可能会有部分介酸混入，使神经酸的纯度降低，进而降低神经酸的质量，影响其后续的使用。
因此，如何提供一种以蒜头果为原料提取并纯化神经酸的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明采用植物化学分离纯化技术，采用柱层析分离法，一步分离神经酸得到高纯度神经酸产品，其纯度高达95％以上，并且同时分离得到油酸、芥酸、山嵛酸、花生酸等单纯脂肪酸。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种从蒜头果油中分离神经酸的方法，包括下述步骤：
步骤一、蒜头果油的提取：
1)预处理：取蒜头果种仁，粉碎，并过20-40目筛，然后95-105℃蒸制20-30min，得到原料；
2)提取：按液料比1:3-5V：V向步骤1)所得原料中加入乙醇，超声波辅助提取30-40min，得到提取液；
3)纯化：对步骤2)中的提取液进行抽滤，取滤液，减压浓缩，除去乙醇得蒜头果油；
步骤二、神经酸的分离
4)柱层析：称取蒜头果油，按照上样量：硅胶量为1:10-20V:V的比例进行硅胶柱层析分离，同时以石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱，每个梯度洗脱4-5个保留体积，收集石油醚∶乙酸乙酯为100:3的洗脱液，减压浓缩，得到神经酸。
作为本发明优选的技术方案，步骤2)中，超声波辅助提取的功率为120-150w、温度为30-40℃、提取2-3次。
作为本发明优选的技术方案，步骤4)中，进行梯度洗脱时，先以纯石油醚进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到介酸；然后以石油醚：乙酸乙酯为100:1的比例进行洗脱，收集洗脱液，在40-50℃下减压浓缩，得到油酸；再以石油醚：乙酸乙酯为100:2的比例进行洗脱，收集洗脱液，40-50℃减压浓缩，得到亚油酸；再以石油醚∶乙酸乙酯为100:3的比例进行洗脱，收集洗脱液，40-50℃减压浓缩，得到神经酸；再以石油醚∶乙酸乙酯为100:10的比例进行洗脱，收集洗脱液，40-50℃减压浓缩，得到山嵛酸；收集石油醚：乙酸乙酯为100:25部分，40-50℃减压浓缩，得到花生酸。
一种从蒜头果油中分离神经酸的方法所得的神经酸在制备抗老年痴呆症的药物中的应用。
一种从蒜头果油中分离神经酸的方法所得的神经酸在制备抗脑功能退化症的药物中的应用。
一种从蒜头果油中分离神经酸的方法所得的神经酸在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。
一种从蒜头果油中分离神经酸的方法所得的神经酸在制备功能性食品中的应用。
经由上述的技术方案可知，本发明达到的技术效果是：
1)从蒜头果仁到油的提取采用超声波辅助，以食用级乙醇为提取溶剂对蒜头果种仁油进行提取，可以最大限度地提取蒜头果仁中的油脂，与传统方法相比，本发明提高了油脂的萃取效率，缩短了提取时间，且不需要大型设备即可完成；
2)设备和试剂投入成本低，操作简单，一步提取，无废液污染，剩余残渣还可作为提取蛋白质、多糖的原料；
3)本发明在从蒜头果油中提取纯化神经酸的同时可同步分离出芥酸等6个脂肪酸纯品的一步提取工艺是本发明的最大亮点，本发明首先采用硅胶柱层析法对蒜头果油中所含神经酸进行提取纯化；关键技术要点是采用混合溶剂梯度洗脱，可同步分离并精制得到6个脂肪酸纯品，能较好的将毒副作用较大的的芥酸与目标产物神经酸分离开来，并可使芥酸及等其他非目标成分得到单独应用，也提高了神经酸的含量与纯度，此方法得到的神经酸含量高达98％，可将其作为生产神经酸和相关产品的精制原料。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种从蒜头果油中分离神经酸的方法，包括下述步骤：
步骤一、蒜头果油的提取：
1)预处理：取蒜头果种仁，粉碎，并过20目筛，然后95℃蒸制20min，得到原料；
2)提取：按液料比1:3V：V向步骤1)所得原料中加入乙醇，超声波辅助提取30min，超声波辅助提取的功率为120w、温度为30℃、提取2次，得到提取液；
3)纯化：对步骤2)中的提取液进行抽滤，取滤液，减压浓缩，除去乙醇得蒜头果油；
步骤二、神经酸的分离
4)柱层析：称取蒜头果油，按照上样量：硅胶量为1:10V:V的比例进行硅胶柱层析分离，先以纯石油醚进行洗脱，收集洗脱液，在40℃下减压浓缩，得到化合物1；
然后以石油醚：乙酸乙酯为100:1的比例进行洗脱，收集洗脱液，在40℃下减压浓缩，得到化合物2；
再以石油醚：乙酸乙酯为100:2的比例进行洗脱，收集洗脱液，40℃减压浓缩，得到化合物3；
再以石油醚∶乙酸乙酯为100:3的比例进行洗脱，收集洗脱液，40℃减压浓缩，得到化合物4；
再以石油醚∶乙酸乙酯为100:10的比例进行洗脱，收集洗脱液，40℃减压浓缩，得到化合物5；
收集石油醚：乙酸乙酯为100:25部分，40℃减压浓缩，得到化合物6；
每个梯度洗脱4个保留体积。
实施例2
一种从蒜头果油中分离神经酸的方法，包括下述步骤：
步骤一、蒜头果油的提取：
1)预处理：取蒜头果种仁，粉碎，并过40目筛，然后105℃蒸制30min，得到原料；
2)提取：按液料比1:5V：V向步骤1)所得原料中加入乙醇，超声波辅助提取30-40min，超声波辅助提取的功率为150w、温度为40℃、提取3次，得到提取液；
3)纯化：对步骤2)中的提取液进行抽滤，取滤液，减压浓缩，除去乙醇得蒜头果油；
步骤二、神经酸的分离
4)柱层析：称取蒜头果油，按照上样量：硅胶量为1:20V:V的比例进行硅胶柱层析分离，先以纯石油醚进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到化合物1；
然后以石油醚：乙酸乙酯为100:1的比例进行洗脱，收集洗脱液，在50℃下减压浓缩，得到化合物2；
再以石油醚：乙酸乙酯为100:2的比例进行洗脱，收集洗脱液，50℃减压浓缩，得到化合物3；
再以石油醚∶乙酸乙酯为100:3的比例进行洗脱，收集洗脱液，50℃减压浓缩，得到化合物4；
再以石油醚∶乙酸乙酯为100:10的比例进行洗脱，收集洗脱液，50℃减压浓缩，得到化合物5；
收集石油醚：乙酸乙酯为100:25部分，50℃减压浓缩，得到化合物6；
每个梯度洗脱5个保留体积。
实施例3
一种从蒜头果油中分离神经酸的方法，包括下述步骤：
步骤一、蒜头果油的提取：
1)预处理：取蒜头果种仁，粉碎，并过30目筛，然后100℃蒸煮25min，得到原料；
2)提取：按液料比1:4V：V向步骤1)所得原料中加入乙醇，超声波辅助提取30-40min，超声波辅助提取的功率为130w、温度为35℃、提取3次，得到提取液；
3)纯化：对步骤2)中的提取液进行抽滤，取滤液，减压浓缩，除去乙醇得蒜头果油；
步骤二、神经酸的分离
4)柱层析：称取蒜头果油，按照上样量：硅胶量为1:15V:V的比例进行硅胶柱层析分离，先以纯石油醚进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到化合物1；
然后以石油醚：乙酸乙酯为100:1的比例进行洗脱，收集洗脱液，在45℃下减压浓缩，得到化合物2；
再以石油醚：乙酸乙酯为100:2的比例进行洗脱，收集洗脱液，45℃减压浓缩，得到化合物3；
再以石油醚∶乙酸乙酯为100:3的比例进行洗脱，收集洗脱液，45℃减压浓缩，得到化合物4；
再以石油醚∶乙酸乙酯为100:10的比例进行洗脱，收集洗脱液，45℃减压浓缩，得到化合物5；
收集石油醚：乙酸乙酯为100:25部分，45℃减压浓缩，得到化合物6；
每个梯度洗脱5个保留体积。
实施例4
化合物的结构鉴定：
对实施例3获得的单体化合物进行GC-MS分析后，鉴定出化合物，其化合物保留时间与所占组分含量百分比如表1-表6所示。
表1化合物1保留时间及含量百分比
表2化合物2保留时间及含量百分比
表3化合物3保留时间及含量百分比
表4化合物4保留时间及含量百分比
表5化合物5保留时间及含量百分比
表6化合物6的保留时间及含量百分比
由表1-表6可知，化合物1为芥酸，化合物2为油酸，化合物3为亚油酸，化合物4为神经酸，化合物5为山嵛酸，化合物6为花生酸；证明通过实施例1-3的方法于蒜头果中提取神经酸可以有效去除其它杂质，通过设置洗脱液的梯度，可以有效地将其它的有机酸酯除去，进而提高神经酸的纯度，并利于其后续的应用。
实施例5
以实施例3制备得到的神经酸为原料，制备神经酸乳剂、神经酸硬胶囊和神经酸软胶囊，过程为：
神经酸乳剂：神经酸6.0％，加入药用植物油36％，乳化剂0.4％，辅助乳化剂6％，抗氧剂0.08％，其余为制药用水，在2000r/min搅拌下，采用交替加液乳化法将其制备成神经酸乳剂。
神经酸硬胶囊：神经酸6％，加入可溶性淀粉54％、微粉硅胶0.1％、硬脂酸镁0.6％，羧甲基纤维素钠1.5％。在干燥环境中，搅拌混匀装入0号胶囊壳中，制成神经酸硬胶囊。
神经酸软胶囊：神经酸35％，加入植物油64.5％，维生素E0.5％，搅拌混合均匀，灌入明胶软胶囊壳中，制备成神经酸软胶囊。
为进一步考察本发明所提取的神经酸有改善抗老年痴呆症、抗脑功能退化及抑制乙酰胆碱酶的活性的效果，现根据胆碱能损伤学说，测定不同抗老年痴呆药物和本发明制备的神经酸产品的抗乙酰胆碱酯酶活性，结果见表7；
表7
由表7可知，实施例3制备得到的神经酸对乙酰胆碱酯酶有明显的抑制作用，进而可以改善老年痴呆，并防止脑功能退化。
原理：乙酰胆碱是哺乳动物脑神经中最重要的神经递质，神经元间乙酰胆碱含量的高低，直接影响中枢神经信息传递功能，脑功能退化患者脑内神经递质乙酰胆碱水平明显降低。神经酸对抗老年痴呆症的功效，主要是通过对乙酰胆碱有水解作用的乙酰胆碱酶的调控来实现的。乙酰胆碱的含量又受控于乙酰胆碱酶的水解作用，而神经酸对乙酰胆碱酶有显著的抑制作用，神经酸则可通过抑制乙酰胆碱酶的活性，来降低乙酰胆碱酶水解乙酰胆碱的作用，从而可提高患者脑中乙酰胆碱的含量，因此可通过体外测定药物对乙酰胆碱酯酶的抑制率来证明其具有抗老年痴呆等脑功能退化症的功效与作用。
实施例6
以实施例3制备得到的神经酸为主要成分制备成适合中老年人的糖果，制备方法如下：
健脑糖丸：神经酸0.6％，柠檬酸0.6％，植物油0.8％，白砂糖28％，麦芽糖浆补充至100％。将麦芽糖加热，融化，加入白砂糖，植物油，用柠檬酸调节酸度和口感，最后加入植物油溶解的神经酸，搅拌均匀，倒入模具，冷却，即得神经酸健脑糖丸。
为进一步考察本发明药物的临床疗效和安全性，选择30例对本实施例功能性食物和药物的疗效进行临床观察。效果标准：治愈：无健忘，记忆力恢复正常。好转：健忘明显减轻。未愈：健忘无明显改善，记忆力无明显好转。
经治疗30例，治愈25例，好转3例，未愈2例，总有效率93％；没有任何副作用和不良反应。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
