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具有稳定的枯草杆菌蛋白酶的液体自动餐具清洗洗涤剂组合物

2021-01-31 21:18:30

具有稳定的枯草杆菌蛋白酶的液体自动餐具清洗洗涤剂组合物

  本发明申请是基于申请日为2014年04月23日、申请号为201480022673.5(国际申请号为PCT/EP2014/058281)、名称为“具有稳定的枯草杆菌蛋白酶的液体自动餐具清洗洗涤剂组合物”的发明专利申请的分案申请。

  对序列表的引用

  本申请包含一个计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。

  发明领域

  本发明涉及枯草杆菌蛋白酶在液体自动餐具清洗(ADW)洗涤剂中的稳定性。

  背景技术

  通常用一定含量的助洗剂配制液体自动餐具清洗(ADW)洗涤剂。该配制品可以包括强螯合助洗剂(例如,含磷助洗剂,如磷酸盐和膦酸盐),并且它还可以包括其他助洗剂(例如,弱助洗剂或沉淀助洗剂,如碳酸钠、碳酸氢钠和柠檬酸钠)。典型地,不用任何阴离子型表面活性剂配制液体ADW洗涤剂,但是它们可含有或可不含非离子型表面活性剂。

  当配制一种液体餐具清洗(ADW)洗涤剂时,令人希望的是包括一种枯草杆菌蛋白酶类型的蛋白酶,以便改善蛋白质污物的去除。然而,枯草杆菌蛋白酶在洗涤剂中的储存稳定性存在着问题。

  WO%2094/29428披露了包含酶和酶稳定系统的液体ADW洗涤剂,这些洗涤剂不含含磷助洗剂。WO%2094/04651和WO%202009/118375披露了包含蛋白酶和作为可逆蛋白酶抑制剂的肽醛的液体洗涤剂。

  发明内容

  本发明人已发现,将一种强螯合助洗剂掺入一种液体ADW洗涤剂中趋向于使得任何存在的枯草杆菌蛋白酶不稳定,但是掺入一种肽醛对于枯草杆菌蛋白酶在包含一种强螯合助洗剂的液体ADW洗涤剂中的稳定特别有效。

  因此,本发明提供了一种液体(餐具清洗洗涤剂)组合物,包括:

  a)一种强螯合助洗剂,

  b)一种枯草杆菌蛋白酶,以及

  c)一种枯草杆菌蛋白酶抑制剂,该抑制剂是一种肽醛或其亚硫酸氢盐加合物或一种肽甲基酮,其中该甲基可任选地被卤素取代,并且其中该肽可任选地具有一个N端保护基团;

  其中该组合物实质上不含阴离子型表面活性剂。

  具体地,本发明涉及如下各项:

  1.一种液体餐具清洗洗涤剂组合物,包括:

  a)一种强螯合助洗剂,

  b)一种枯草杆菌蛋白酶,以及

  c)一种枯草杆菌蛋白酶抑制剂,该抑制剂是一种肽醛或其亚硫酸氢盐加合物或一种肽甲基酮,其中该甲基可任选地被卤素取代,并且其中该肽可任选地具有一个N端保护基团;

  其中该组合物实质上不含阴离子型表面活性剂。

  2.如前述项所述的组合物,其具有按重量计低于5%的含量的非离子型表面活性剂。

  3.如任一前述项所述的组合物,其包括按重量计高于0.1%的量的强螯合助洗剂。

  4.如任一前述项所述的组合物,其中该强螯合助洗剂是一种含磷助洗剂。

  5.如前述项所述的组合物,其包括对应于按该组合物的重量计至少0.1%,尤其是按重量计1%以上、2%以上、3%以上、4%以上或5%以上的磷含量的量的含磷助洗剂。

  6.如任一前述项所述的组合物,其进一步包括一种另外的洗涤剂酶;优选一种淀粉酶。

  7.如任一前述项所述的组合物,其中该抑制剂是一种具有式P-(A)y-L-(B)x-B0-R*的醛或酮或这种醛的亚硫酸氢盐加合物,其中:

  a)R*是H(氢)、CH3、CX3、CHX2或CH2X;

  b)X是卤素原子;

  c)B0是具有式-NH-CH(R)-C(=O)-的L-或D-构型的单一氨基酸残基;

  d)x是1、2或3;

  e)Bx独立地是各自经由其C端连接到下一个B或B0上的单一氨基酸残基;

  f)L不存在或独立地是具有式-C(=O)-、-C(=O)-C(=O)-、-C(=S)-、-C(=S)-C(=S)-或-C(=S)-C(=O)-的连接基团;

  g)A不存在(如果L不存在)或独立地是经由氨基酸的N端连接到L上的单一氨基酸残基;

  h)P选自下组,该组由以下各项组成:氢或(如果L不存在)一种N端保护基团;

  i)y是0、1或2,

  j)R独立地选自下组,该组由以下各项组成:任选地被一个或多个相同或不同的取代基R'取代的C1-6烷基、C6-10芳基或C7-10芳烷基;

  k)R’独立地选自下组,该组由以下各项组成:卤素、-OH、-OR”、-SH、-SR”、-NH2、-NHR”、-NR”2、-CO2H、-CONH2、-CONHR”、-CONR”2、-NHC(=N)NH2;并且

  l)R”是一个C1-6烷基。

  m)x可以是1、2或3。

  8.如任一前述项所述的组合物,其中该抑制剂是一种具有式P-B2-B1-B0-H的醛或一种具有式P-B2-B1-N(H)-CHR-CHOH-SO3M的加合物,其中

  a)H是氢;

  b)B0是具有式-NH-CH(R)-C(=O)-的L-或D-构型的单一氨基酸残基;

  c)B1和B2独立地是单一氨基酸残基;

  d)R独立地选自下组,该组由以下各项组成:任选地被一个或多个相同或不同的取代基R'取代的C1-6烷基、C6-10芳基或C7-10芳烷基;

  e)R’独立地选自下组,该组由以下各项组成:卤素、-OH、-OR”、-SH、-SR”、-NH2、-NHR”、-NR”2、-CO2H、-CONH2、-CONHR”、-CONR”2、-NHC(=N)NH2;

  f)R”是一个C1-6烷基;并且

  g)P是一个N端保护基团。

  9.如项7或8所述的组合物,其中R是这样的,使得B0=-NH-CH(R)-C(=O)-是Phe、Tyr或Leu。

  10.如项7-9中任一项所述的组合物,其中B1是Ala、Gly或Val。

  11.如项7-10中任一项所述的组合物,其中B2是Arg、Phe、Tyr或Trp。

  12.如项7-11中任一项所述的组合物,其中x=2,L不存在,A不存在,并且P是对甲氧羰基(Moc)或苄氧羰基(Cbz)。

  13.如任一前述项所述的组合物,其中该抑制剂是Cbz-Arg-Ala-Tyr-H、Ac-Gly-Ala-Tyr-H、Cbz-Gly-Ala-Tyr-H、Cbz-Gly-Ala-Tyr-CF3、Cbz-Gly-Ala-Leu-H、Cbz-Val-Ala-Leu-H、Cbz-Val-Ala-Leu-CF3、Moc-Val-Ala-Leu-CF3、Cbz-Gly-Ala-Phe-H、Cbz-Gly-Ala-Phe-CF3、Cbz-Gly-Ala-Val-H、Cbz-Gly-Gly-Tyr-H、Cbz-Gly-Gly-Phe-H、Cbz-Arg-Val-Tyr-H、Cbz-Leu-Val-Tyr-H、Ac-Leu-Gly-Ala-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Tyr-H、Ac-Tyr-Gly-Ala-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Leu-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Phe-H、Ac-Phe-Gly-Val-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Met-H、Ac-Trp-Leu-Val-Tyr-H、MeO-CO-Val-Ala-Leu-H、MeNCO-Val-Ala-Leu-H、MeO-CO-Phe-Gly-Ala-Leu-H、MeO-CO-Phe-Gly-Ala-Phe-H、MeSO2-Phe-Gly-Ala-Leu-H、MeSO2-Val-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Val-Ala-Leu-H、EtSO2-Phe-Gly-Ala-Leu-H、PhCH2SO2-Val-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Leu-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Phe-Ala-Leu-H、或MeO-P(OH)(O)-Leu-Gly-Ala-Leu-H或任何这些的亚硫酸氢盐加合物,其中Cbz是苄氧羰基并且Moc是甲氧羰基。

  14.如任一前述项所述的组合物,其中该抑制剂是Cbz-Gly-Ala-Tyr-H或Moc-Val-Ala-Leu-H、或其亚硫酸氢盐加合物,其中Cbz是苄氧羰基并且Moc是甲氧羰基。

  15.如任一前述项所述的组合物,其中该强助洗剂是三聚磷酸盐、乙二胺四乙酸、有机膦酸盐或焦磷酸盐,尤其是如碱金属盐。

  16.如任一前述项所述的组合物,其中该抑制剂和该枯草杆菌蛋白酶以至少为1:1的摩尔比存在。

  17.如任一前述项所述的组合物,其中该枯草杆菌蛋白酶具有以下氨基酸序列,其与SEQ%20ID%20NO:1或SEQ%20ID%20NO:4具有至少80%序列一致性,或其与SEQ%20ID%20NO:1或SEQ%20IDNO:4相比具有多达10个氨基酸变化。

  本发明的其他方面和实施例在说明书和实例下是显而易见的。

  发明详述

  枯草杆菌蛋白酶

  在本发明的上下文中,枯草杆菌蛋白酶家族(EC%203.4.21.62)应理解为如下文献所述:西仁(Siezen)等人,蛋白质工程(Protein%20Engng.)4(1991)719-737;和西仁等人,蛋白质科学(Protein%20Science)6(1997)501-523。如文中所描述的,枯草杆菌蛋白酶家族可以划分为3个亚组,即I-S1(“真正的”枯草杆菌蛋白酶)、I-S2(高碱性蛋白酶)以及细胞内枯草杆菌蛋白酶。

  枯草杆菌蛋白酶的实例是来源于芽孢杆菌的那些,如枯草杆菌蛋白酶lentus、迟缓芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶Novo、嘉士伯枯草杆菌蛋白酶(subtilisin%20Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO%2089/06279中)以及蛋白酶PD138(WO%2093/18140)。另外的实例描述于WO98/020115、WO%2001/44452、WO%2001/58275、WO%2001/58276、WO%2003/006602以及WO%2004/099401中。

  有用的变体的实例描述于WO%2092/19729、WO%2098/20115、WO%2098/20116以及WO%2098/34946中,尤其是在一个或多个以下位置中具有取代的变体:3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274,使用BPN’编号。更优选地,这些枯草杆菌酶变体可以包括以下突变:S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R%20S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN'编号)。

  可商购的枯草杆菌蛋白酶的实例包括KannaseTM、EverlaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、EsperaseTM、AlcalaseTM、DurazymTM、SavinaseTM、OvozymeTM、LiquanaseTM、CoronaseTM、PolarzymeTM、PyraseTM以及Clear-LensTM%20Pro;BlazeTM(诺维信公司(NovozymesA/S))。其他可商购的蛋白酶包括RonozymeTM%20Pro、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、OpticleanTM、ProperaseTM、PurafectTM、Purafect%20OxTM、Purafact%20PrimeTM、ExcellaseTM、FN2TM、FN3TM以及FN4TM(可从杜邦公司(Dupont)获得)。

  在本发明的一个实施例中,该枯草杆菌蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶309或枯草杆菌蛋白酶BPN’、或任何这些的变体。优选地,该枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列与SEQ%20ID%20NO:1或SEQ%20ID%20NO:4的氨基酸序列具有至少70%的序列一致性,优选地至少75%,更优选地至少80%,更优选地至少85%,更优选地至少90%,更优选地至少95%、96%、97%、98%、99%,并且最优选地100%的序列一致性。在一个实施例中,该枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列是SEQ%20ID%20NO:1、SEQ%20ID%20NO:2、SEQ%20ID%20NO:3或SEQ%20ID%20NO:4。

  在一个实施例中,引入SEQ%20ID%20NO:1或SEQ%20ID%20NO:4的氨基酸序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个,例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个;或多达5个,例如1个、2个、3个、4个或5个。这些氨基酸变化可以具有微小性质,即,不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入;典型地1-30个氨基酸的小缺失;小的氨基-或羧基-末端延伸,如氨基末端的甲硫氨酸残基;多达20-25个残基的小接头肽;或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸,如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。

  保守取代的实例是在下组的范围内:碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(H.Neurath)和R.L.希尔(R.L.Hill),1979,在蛋白质(TheProteins),学术出版社,纽约中描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu以及Asp/Gly。

  可以根据本领域中已知的程序,如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells),1989,科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中,在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变,并且测试所得突变分子的枯草杆菌蛋白酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见,希尔顿(Hilton)等人,1996,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可以结合假定接触位点氨基酸的突变,通过如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记等技术进行测定,来对结构进行物理学分析,从而确定枯草杆菌蛋白酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见,例如,德弗斯(de%20Vos)等人,1992,科学(Science)255:306-312;史密斯(Smith)等人,1992,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904;乌乐达维尔(Wlodaver)等人,1992,欧洲生化学会联合会快报(FEBS%20Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴定必需氨基酸。

  可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试,随后进行相关筛选程序,如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer),1988,科学(Science)241:53-57;博维(Bowie)和萨奥尔,1989,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156;WO%2095/17413;或WO%2095/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如,洛曼(Lowman)等人,1991,生物化学(Biochemistry)30:10832-10837;美国专利号5,223,409;WO%2092/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人,1986,基因(Gene)46:145;内尔(Ner)等人,1988,DNA7:127)。

  两个氨基酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。出于本发明的目的,使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件(The%20European%20MolecularBiology%20Open%20Software%20Suite),赖斯(Rice)等人,2000,遗传学趋势(Trends%20Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施),1970,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10,空位延伸罚分0.5,以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性,并且如下计算:

  (一致的残基X100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

  任选的另外的酶

  除了枯草杆菌蛋白酶之外,该组合物能可任选地包括一种或多种另外的洗涤剂酶,例如,5种、4种、3种、2种或1种另外的酶。这些另外的酶可以包括另外的蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过水解酶、漆酶、过氧化物酶和/或卤代过氧化物酶。优选地,该另外的酶是一种淀粉酶。

  一般而言,一种或多种所选酶的性质应与选定的洗涤剂相容(即,最适pH,与其他酶和非酶成分的相容性,等等),并且该一种或多种酶应以有效量存在。

  脂肪酶和角质酶

  适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。实例包括来自嗜热真菌属(Thermomyces)的脂肪酶,例如来自如在EP258068和EP%20305216中描述的疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(之前命名为柔毛腐质霉);来自腐质霉属的角质酶,例如在WO%2096/13580中描述的特异腐质霉;一种假单胞菌属脂肪酶,例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP%20218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP%20331376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB1372034)、萤光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株SD%20705(WO%2095/06720和WO%2096/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO%2096/12012);一种芽孢杆菌属脂肪酶,例如来自枯草芽孢杆菌(达托斯(Dartois)等人,生物化学与生物物理学学报(Biochemicaet%20Biophysica%20Acta),(1993),1131,253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP%2064/744992)或短小芽孢杆菌(WO%2091/16422);GDSL型链霉菌属脂肪酶(WO%2010/065455);来自稻瘟病菌的角质酶(WO%2010/107560);来自门多萨假单胞菌的角质酶(US%205,389,536);来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida%20fusca)的脂肪酶(WO%2011/084412);嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO%2011/084417);来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO%2011/084599);以及来自灰色链霉菌(WO%2011/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)(WO%2012/137147)的脂肪酶。

  其他实例是例如WO%2092/05249、WO%2094/01541、EP%20407225、EP%20260105、WO%2095/35381、WO%2096/00292、WO%2095/30744、WO%2094/25578、WO%2095/14783、WO%2095/22615、WO%2097/04079、WO%2097/07202、WO%2000/060063、WO%2007/087508以及WO%2009/109500中所描述的那些脂肪酶变体。

  优选的可商购的脂肪酶包括LipolaseTM、Lipolase%20UltraTM、以及LipexTM;LecitaseTM、LipolexTM;LipocleanTM、LipoprimeTM(诺维信公司)。其他可商购的脂肪酶包括Lumafast(杰能科国际公司(Genencor%20Int%20Inc));Lipomax(吉斯特·布罗卡德斯公司(Gist-Brocades)/杰能科国际公司)和来自苏威(Solvay)的芽孢杆菌属脂肪酶。

  糖酶

  糖酶是裂解碳水化合物的酶的通用术语。一般来说,糖酶以它们所起作用的底物命名,例如淀粉酶对淀粉酶起作用并且纤维素酶对纤维素起作用。许多糖酶已经适用于清洁和洗衣应用中,如淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶以及木聚糖酶,并且所有这些糖酶都可以应用于液体组合物中。

  淀粉酶

  适合的淀粉酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属获得的α-淀粉酶,例如,在GB%201,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌的特定菌株。

  适合的淀粉酶的实例包括具有WO%2095/10603中的SEQ%20ID%20NO:2的淀粉酶或其与SEQID%20NO:3具有90%序列一致性的变体。优选变体描述于WO%2094/02597、WO%2094/18314、WO%2097/43424以及WO%2099/019467的SEQ%20ID%20NO:4中,例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体:15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。

  不同的适合的淀粉酶包括具有WO%2002/010355中的SEQ%20ID%20NO:6的淀粉酶或其与SEQ%20ID%20NO:6具有90%序列一致性的变体。SEQ%20ID%20NO:6的优选变体是在位置181和182中具有一个缺失并且在位置193中具有一个取代的那些。其他适合的淀粉酶是包括示于WO2006/066594的SEQ%20ID%20NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO2006/066594的SEQ%20ID%20NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90%序列一致性的变体。此杂合α-淀粉酶的优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些:G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO%202006/066594的SEQ%20ID%20NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ%20ID%20NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些:

  M197T;

  H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S;或

  G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

  适合的另外的淀粉酶是具有WO%2099/019467中的SEQ%20ID%20NO:6的淀粉酶或其与SEQID%20NO:6具有90%序列一致性的变体。SEQ%20ID%20NO:6的优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些:R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。

  可以使用的另外的淀粉酶是具有WO%2096/023873的SEQ%20ID%20NO:1、SEQ%20ID%20NO:3、SEQID%20NO:2或SEQ%20ID%20NO:7的那些或其与SEQ%20ID%20NO:1、SEQ%20ID%20NO:2、SEQ%20ID%20NO:3或SEQ%20IDNO:7具有90%序列一致性的变体。SEQ%20ID%20NO:1、SEQ%20ID%20NO:2、SEQ%20ID%20NO:3或SEQ%20ID%20NO:7的优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些:140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在位置181和182或位置183和184中具有缺失的那些。SEQ%20ID%20NO:1、SEQ%20ID%20NO:2或SEQ%20ID%20NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476中的一个或多个中具有取代的那些。

  可以使用的其他淀粉酶是具有WO%2008/153815中的SEQ%20ID%20NO:2、WO%2001/66712中的SEQ%20ID%20NO:10的淀粉酶或其与WO%2008/153815的SEQ%20ID%20NO:2具有90%序列一致性或与WO01/66712中的SEQ%20ID%20NO:10具有90%序列一致性的变体。WO%2001/66712中的SEQ%20ID%20NO:10的优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些:176、177、178、179、190、201、207、211以及264。

  另外的适合的淀粉酶是具有WO%2009/061380中的SEQ%20ID%20NO:2的淀粉酶或其与SEQID%20NO:2具有90%序列一致性的变体。SEQ%20ID%20NO:2的优选变体是在一个或多个以下位置中具有C端截短和/或取代、缺失或插入的那些:Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQ%20ID%20NO:2的更优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代的那些:Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQ%20ID%20NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些:

  N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;

  N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;

  S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;或

  S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K,其中这些变体是C端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。

  其他适合的淀粉酶是具有WO%2001/66712中的SEQ%20ID%20NO:12的α-淀粉酶或与SEQ%20IDNO:12具有至少90%序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO%2001/66712中的SEQ%20IDNO:12的一个或多个以下位置中具有取代、缺失或插入的那些:R28、R118、N174;R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314;R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的变体,以及另外在选自下组的一个或多个位置中具有取代的变体:M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339,最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。

  其他实例是例如描述于WO%202011/098531、WO%202013/001078及WO%202013/001087中的那些淀粉酶变体。

  可商购的淀粉酶是Stainzyme;Stainzyme%20Plus;DuramylTM、TermamylTM、TermamylUltra;Natalase、FungamylTM和BANTM(诺维信公司)、RapidaseTM和PurastarTM/EffectenzTM、Powerase和Preferenz%20S100(来自杰能科国际公司(Genencor%20International%20Inc.)/杜邦公司)。

  裂解酶

  裂解酶可以是一种果胶酸裂解酶,来源于芽孢杆菌属,尤其是地衣芽孢杆菌或粘琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens),或一种来源于这些来源中任一种的变体,例如,正如在US%206124127、WO%2099/027083、WO%2099/027084、WO%2002/006442、WO%2002/092741、WO%2003/095638中所述的,可商购的果胶酸裂解酶是XPect;Pectawash和Pectaway(诺维信公司)。

  甘露聚糖酶

  甘露聚糖酶可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。它可以是一种来自芽孢杆菌属或腐质霉属的野生型,特别是粘琼脂芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、耐盐嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)或特异腐质霉。适合的甘露聚糖酶描述于WO99/064619中。一种可商购的甘露聚糖酶是Mannaway(诺维信公司)。

  纤维素酶

  适合的纤维素酶可以是细菌或真菌来源的。包括化学或基因修饰的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶,例如,从在US%204,435,307、US%205,648,263、US%205,691,178、US%205,776,757以及WO89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。

  尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP%200%20495%20257、EP%200%20531%20372、WO%2096/11262、WO%2096/29397、WO%2098/08940中的纤维素酶。其他实例为例如在WO%2094/07998、EP%200%20531%20315、US%205,457,046、US%205,686,593、US中描述的那些纤维素酶变体。

  可商购的纤维素酶包括CarezymeTM、CelluzymeTM、CellucleanTM、CelluclastTM以及EndolaseTM;雷诺酶(Renozyme);怀特酶(Whitezyme)(诺维信公司)、ClazinaseTM、普拉达克(Puradax)、普拉达克HA(Puradax%20HA)以及普拉达克EG(Puradax%20EG)(可从杰能科获得)以及KAC-500(B)TM(花王公司(Kao%20Corporation))。

  过氧化物酶/氧化酶

  适合的过氧化物酶包括由国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)命名委员会陈述的酶分类EC%201.11.1.7,或源自其中的展示出过氧化物酶活性的任何片段。

  适合的过氧化物酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自拟鬼伞属,例如来自灰盖拟鬼伞(C.cinerea)的过氧化物酶(EP%20179,486),及其变体,如在WO%2093/24618、WO%2095/10602以及WO%2098/15257中描述的那些。

  这些过氧化物酶还包括卤代过氧化物酶,例如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶以及展示出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。根据其对卤素离子的特异性将卤代过氧化物酶加以分类。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化从氯根离子形成次氯酸盐。

  在一个实施例中,本发明的卤代过氧化物酶是氯过氧化物酶。优选地,该卤代过氧化物酶是钒卤代过氧化物酶,即含钒酸盐的卤代过氧化物酶。在本发明的一个优选方法中,将含钒酸盐的卤代过氧化物酶与氯根离子来源组合。

  已经从许多不同真菌,特别是从暗色丝孢菌(dematiaceous%20hyphomycete)真菌组中分离出了卤代过氧化物酶,比如卡尔黑霉属(Caldariomyces)(例如煤卡尔黑霉(C.fumago))、链格孢属、弯孢属(例如疣枝弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis))、内脐蠕孢属、细基格孢属以及葡萄孢属。

  还已经从细菌,如假单胞菌属(例如,吡咯假单胞菌(P.pyrrocinia))和链霉菌属(例如,金色链霉菌(S.aureofaciens))中分离出了卤代过氧化物酶。

  在一个优选实施方案中,该卤代过氧化物酶可源自弯孢属,特别是疣枝弯孢(Curvularia%20verruculosa)和不等弯孢,例如如描述于WO%2095/27046中的不等弯孢CBS102.42或描述于WO%2097/04102中的疣枝弯孢CBS%20147.63或疣枝弯孢CBS%20444.70;或可源自如描述于WO%2001/79459中的Drechslera%20hartlebii,如描述于WO%2001/79458中的盐沼小树状霉(Dendryphiella%20salina)、如描述于WO%2001/79461中的Phaeotrichoconis%20crotalarie或如描述于WO%2001/79460中的Geniculosporium%20sp.。

  适合的氧化酶具体包括由酶分类EC%201.10.3.2囊括的任何漆酶或源自其中的展示出漆酶活性的任何片段、或展示出类似活性的化合物,例如儿茶酚氧化酶(EC%201.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC%201.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC%201.3.3.5)。

  优选的漆酶是微生物来源的酶。这些酶可以源自植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。

  来自真菌的适合实例包括可源自以下项的菌株的漆酶:曲霉属,脉孢菌属(例如,粗糙脉孢菌),柄孢壳菌属,葡萄孢属,金钱菌属(Collybia),层孔菌属(Fomes),香菇属,侧耳属,栓菌属(例如,长绒毛栓菌和变色栓菌),丝核菌属(例如,立枯丝核菌(R.solani)),拟鬼伞属(例如,灰盖拟鬼伞、毛头拟鬼伞(C.comatus)、弗瑞氏拟鬼伞(C.friesii)及C.plicatilis),小脆柄菇属(Psathyrella)(例如,白黄小脆柄菇(P.condelleana)),斑褶菇属(例如,蝶形斑褶菇(P.papilionaceus)),毁丝霉属(例如,嗜热毁丝霉),Schytalidium(例如,S.thermophilum),多孔菌属(例如,P.pinsitus),射脉菌属(例如,射脉侧菌(P.radiata))(WO%2092/01046)或革盖菌属(例如,毛革盖菌(C.hirsutus))(JP%202238885)。

  来自细菌的适合实例包括可源自芽孢杆菌属的菌株的漆酶。优选的是源自拟鬼伞属或毁丝霉属的漆酶;特别是源自灰盖拟鬼伞的漆酶,如披露于WO%2097/08325中;或源自嗜热毁丝霉,如披露于WO%2095/33836中。

  过水解酶

  适合的过水解酶能够催化过水解反应,该反应导致在过氧化物源(例如,过氧化氢)的存在下从羧酸酯(酰)底物产生过酸。虽然许多酶以低水平进行该反应,过水解酶展示出高的过水解:水解比率,通常大于1。适合的过水解酶可以是植物、细菌或真菌来源的。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。

  有用的过水解酶的实例包括天然存在的分枝杆菌属过水解酶或其变体。一种示例性酶来源于耻垢分枝杆菌。这种酶,其酶特性、其结构及其变体描述于WO%202005/056782、WO2008/063400、US%202008/145353以及US%202007167344中。

  抑制剂

  在本发明的液体组合物中使用的抑制剂是一种肽醛、其亚硫酸氢盐加合物、或一种肽甲基酮。该甲基可任选地被卤素取代,并且该肽可任选地具有一个N端保护基团。

  醛或酮

  该抑制剂可以具有式:P-(A)y-L-(B)x-B0-R*其中:

  R*是H(氢)、CH3、CX3、CHX2或CH2X。优选地,R*=H从而该抑制剂是一种具有式P-(A)y-L-(B)x-B0-H的肽醛;

  X是卤素原子,特别是F(氟);

  B0是具有式-NH-CH(R)-C(=O)-的L-或D-构型的单一氨基酸残基;

  x是1、2或3;

  Bx独立地是各自经由其C端连接到下一个B或B0上的单一氨基酸残基;

  L不存在或独立地是具有式-C(=O)-、-C(=O)-C(=O)-、-C(=S)-、-C(=S)-C(=S)-或-C(=S)-C(=O)-的连接基团;

  A不存在(如果L不存在)或独立地是经由氨基酸的N端连接到L上的单一氨基酸残基;

  P选自下组,该组由以下各项组成:氢或(如果L不存在)一种N端保护基团;

  y是0、1或2,

  R独立地选自下组,该组由以下各项组成:任选地被一个或多个相同或不同的取代基R'取代的C1-6烷基、C6-10芳基或C7-10芳烷基;

  R’独立地选自下组,该组由以下各项组成:卤素、-OH、-OR”、-SH、-SR”、-NH2、-NHR”、-NR”2、-CO2H、-CONH2、-CONHR”、-CONR”2、-NHC(=N)NH2;并且

  R”是一个C1-6烷基。

  x可以是1、2或3并且因此B对应地可以是1、2或3个氨基酸残基。因此,B可以表示B1、B2-B1或B3-B2-B1,其中B3、B2和B1各自表示一个氨基酸残基。y可以是0、1或2并且因此A可以不存在,或是对应地具有式A1或A2-A1的1个或2个氨基酸残基,其中A2和A1各自表示一个氨基酸残基。

  B0可以是具有L-或D-构型的单一氨基酸残基,它经由氨基酸的C端被连接到H上。B0具有式-NH-CH(R)-C(=O)-,其中R是C1-6烷基、C6-10芳基或C7-10芳烷基侧链,如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、苯基或苄基,并且其中R可以任选地被一个或多个相同或不同的取代基R'取代。B0的具体实例是D或L形式的精氨酸(Arg)、3,4-二羟基苯丙氨酸、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、苯丙氨酸(Phe)、间酪氨酸、对酪氨酸(Tyr)以及缬氨酸(Val)。一个具体实施例是当B0是亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、对酪氨酸以及缬氨酸时。

  经由氨基酸的C端连接到B0上的B1可以是脂肪族、疏水性和/或中性氨基酸。B1的实例是丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)以及缬氨酸(Val)。B1的具体实例是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸以及缬氨酸。一个具体实施例是当B1是丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸时。

  如果存在,经由氨基酸的C端连接到B1上的B2可以是脂肪族、疏水性、中性和/或极性氨基酸。B2的实例是丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、卷须霉啶(Cpd)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)以及缬氨酸(Val)。B2的具体实例是丙氨酸、精氨酸、卷须霉啶、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸以及缬氨酸。一个具体实施例是当B2是精氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸时。

  经由氨基酸的C端连接到B2上的B3(如果存在)可以是大型、脂肪族、芳香族、疏水性和/或中性氨基酸。B3的实例是异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、苯丙氨酸(Phe)、苯基甘氨酸、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)以及缬氨酸(Val)。B3的具体实例是亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸。

  连接基团L可以不存在或选自下组,该组由以下各项组成:-C(=O)-、-C(=O)-C(=O)-、-C(=S)-、-C(=S)-C(=S)-或-C(=S)-C(=O)-。本发明的具体实施例是当L不存在或L是羰基-C(=O)-时。

  经由氨基酸的N端连接到L上的A1(如果存在)可以是脂肪族、芳香族、疏水性、中性和/或极性氨基酸。A1的实例是丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、卷须霉啶(Cpd)、甘氨酸(Gly)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)以及缬氨酸(Val)。A1的具体实例是丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及缬氨酸。一个具体实施例是当B2是亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸时。

  经由氨基酸的N端连接到A1上的A2残基(如果存在)可以是大型、脂肪族、芳香族、疏水性和/或中性氨基酸。A2的实例是精氨酸(Arg)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、苯丙氨酸(Phe)、苯基甘氨酸、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)以及缬氨酸(Val)。A2的具体实例是苯丙氨酸和酪氨酸。

  N端保护基团P(如果存在)可以选自甲酰基、乙酰基(Ac)、苄酰基(Bz)、三氟乙酰基、甲氧基丁二酰基、芳香族和脂肪族氨基甲酸酯保护基团,如芴基甲氧羰基(Fmoc)、甲氧羰基(Moc)、(氟甲氧基)羰基、苄氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(Boc)以及金刚烷氧羰基;对甲氧基苄基羰基、苄基(Bn)、对甲氧基苄基(PMB)、对甲氧基苯基(PMP)、甲氧基乙酰基、甲氨基羰基、甲基磺酰基、乙基磺酰基、苄基磺酰基、甲基磷酰胺基(MeOP(OH)(=O))以及苄基磷酰胺基(PhCH2OP(OH)(=O))。

  在含保护基团的三肽醛(即x=2,L不存在并且A不存在)的情况下,P优选地是乙酰基、甲氧羰基、苄氧羰基、甲氨基羰基、甲基磺酰基、苄基磺酰基以及苄基磷酰胺基。在含保护基团的四肽醛(即x=3,L不存在并且A不存在)的情况下,P优选地是乙酰基、甲氧羰基、甲基磺酰基、乙基磺酰基以及甲基磷酰胺基。

  适合的肽醛描述在WO%2094/04651、WO%2095/25791、WO%2098/13458、WO%2098/13459、WO98/13460、WO%2098/13461、WO%2098/13462、WO%2007/141736、WO%2007/145963、WO%2009/118375、WO10/055052以及WO%2011/036153中。更具体地,该肽醛可以是Cbz-Arg-Ala-Tyr-H、Ac-Gly-Ala-Tyr-H、Cbz-Gly-Ala-Tyr-H、Cbz-Gly-Ala-Tyr-CF3、Cbz-Gly-Ala-Leu-H、Cbz-Val-Ala-Leu-H、Cbz-Val-Ala-Leu-CF3、Moc-Val-Ala-Leu-CF3、Cbz-Gly-Ala-Phe-H、Cbz-Gly-Ala-Phe-CF3、Cbz-Gly-Ala-Val-H、Cbz-Gly-Gly-Tyr-H、Cbz-Gly-Gly-Phe-H、Cbz-Arg-Val-Tyr-H、Cbz-Leu-Val-Tyr-H、Ac-Leu-Gly-Ala-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Tyr-H、Ac-Tyr-Gly-Ala-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Leu-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Phe-H、Ac-Phe-Gly-Val-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Met-H、Ac-Trp-Leu-Val-Tyr-H、MeO-CO-Val-Ala-Leu-H、MeNCO-Val-Ala-Leu-H、MeO-CO-Phe-Gly-Ala-Leu-H、MeO-CO-Phe-Gly-Ala-Phe-H、MeSO2-Phe-Gly-Ala-Leu-H、MeSO2-Val-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Val-Ala-Leu-H、EtSO2-Phe-Gly-Ala-Leu-H、PhCH2SO2-Val-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Leu-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Phe-Ala-Leu-H或MeO-P(OH)(O)-Leu-Gly-Ala-Leu-H。用于在本发明的液体组合物中使用的一种优选的抑制剂是Cbz-Gly-Ala-Tyr-H、或其亚硫酸氢盐加合物,其中Cbz是苄氧羰基。

  这类肽醛的另外的实例包括α-MAPI、β-MAPI、Phe-C(=O)-Arg-Val-Tyr-H、Phe-C(=O)-Gly-Gly-Tyr-H、Phe-C(=O)-Gly-Ala-Phe-H、Phe-C(=O)-Gly-Ala-Tyr-H、Phe-C(=O)-Gly-Ala-L-H、Phe-C(=O)-Gly-Ala-Nva-H、Phe-C(=O)-Gly-Ala-Nle-H、Tyr-C(=O)-Arg-Val-Tyr-H、Tyr-C(=O)-Gly-Ala-Tyr-H、Phe-C(=S)-Arg-Val-Phe-H、Phe-C(=S)-Arg-Val-Tyr-H、Phe-C(=S)-Gly-Ala-Tyr-H、抗痛素、GE20372A、GE20372B、糜蛋白酶抑素A、糜蛋白酶抑素B以及糜蛋白酶抑素C。

  亚硫酸氢盐加合物

  该枯草杆菌蛋白酶抑制剂可以是如上所述的醛的亚硫酸氢盐加合物,例如,如在WO%202013/004636中所述的。该加合物可以具有式P-(A)y-L-(B)x-N(H)-CHR-CH(OH)-SO3M,其中P、A、y、L、B、x以及R如上文所定义,并且M是H或碱金属,优选Na或K。一个优选实施例是亚硫酸氢盐加合物,其中P=Cbz;B2=Gly;B1=Ala;B0=Tyr(因此R=PhCH2,R’=OH),x=2,y=0,L=A=不存在并且M=Na。

  醛或亚硫酸氢盐加合物

  该抑制剂可以是一种具有式P-B2-B1-B0-H的醛或一种具有式P-B2-B1-N(H)-CHR-CHOH-SO3M的加合物,其中

  a)H是氢;

  b)B0是具有式-NH-CH(R)-C(=O)-的L-或D-构型的单一氨基酸残基;

  c)B1和B2独立地是单一氨基酸残基;

  d)R独立地选自下组,该组由以下各项组成:任选地被一个或多个相同或不同的取代基R'取代的C1-6烷基、C6-10芳基或C7-10芳烷基;

  e)R’独立地选自下组,该组由以下各项组成:卤素、-OH、-OR”、-SH、-SR”、-NH2、-NHR”、-NR”2、-CO2H、-CONH2、-CONHR”、-CONR”2、-NHC(=N)NH2;

  f)R”是一个C1-6烷基;并且

  g)P是一个N端保护基团。

  组分b)至g)可以如上所述进行选择。

  强螯合助洗剂

  螯合助洗剂不同于沉淀助洗剂,是因为当最初在中性pH下该助洗剂以足够结合在7°dH硬度(德国硬度)的水溶液中的所有钙离子的量使用时,没有形成显著量的沉淀。

  强助洗剂被分类为高效率螯合剂,其能够以高于4,特别是高于5、高于6或高于7的对数稳定常数(Log%20KCa)有力地结合阳离子/螯合剂复合体的二价阳离子(例如,Ca2+)。在0.1M的离子强度和25℃的温度下确定稳定常数。

  更多细节参见例如亚瑟E.马特尔(Arthur%20E.Martell)和罗伯特M.史密斯(RobertM.Smith),临界稳定常数(Critical%20Stability%20Constants),普雷纳姆出版社(PlenumPress),纽约,1975,第1-6卷;或在http://www.nist.gov/srd/nist46.cfm上金属复合物的NIST临界选择的稳定常数(NIST%20Critically%20Selected%20Stability%20Constants%20of%20MetalComplexes)。

  强螯合助洗剂包括例如,如水溶性三聚磷酸盐、乙二胺四乙酸以及有机膦酸盐等材料。碱金属焦磷酸盐也被分类为螯合助洗剂。该强螯合助洗剂可以是一种含磷助洗剂或一种无磷助洗剂。

  含磷助洗剂通常包括一种无机磷酸盐或一种膦酸盐,典型地为一种碱金属盐(例如,钠或钾)。

  无机磷酸盐可以是二磷酸盐、三磷酸盐、三聚磷酸盐或焦磷酸盐。无机磷酸盐的具体实例包括Na5P3O10(STPP或三聚磷酸钠)和Na4P2O7(焦磷酸四钠)。

  膦酸盐可以是烷基膦酸盐、芳基膦酸盐或烷芳基膦酸盐,其中该烷基、芳基或烷芳基可以被取代。膦酸盐的实例包括1-羟基亚乙基-1,1-二膦酸(HEDP,依替膦酸)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、次氮基三亚甲基膦酸(NTMP)、2-氨乙基膦酸(AEPn)、甲基膦酸二甲酯(DMMP)、四亚甲基二胺四(亚甲基膦酸)(TDTMP)、六亚甲基二胺四(亚甲基膦酸)(HDTMP)、膦酰基丁烷-三羧酸(PBTC)、N-(膦酰基甲基)亚氨基二乙酸(PMIDA)、2-羧乙基膦酸(CEPA)以及2-羟基膦酰羧酸(HPAA)。

  无磷强螯合助洗剂可以包括例如乙二胺四乙酸(EDTA)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、次氨基三乙酸(NTA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺二琥珀酸(EDDS)以及L-谷氨酸-N,N-二乙酸四钠盐(GLDA)。

  助洗剂钙复合体的稳定常数的实例罗列如下:

  表1.

  

  

  其他任选的助洗剂

  除了强螯合助洗剂之外,该液体组合物可以任选地包括一种或多种其他助洗剂,例如,一种弱助洗剂或一种沉淀助洗剂。沉淀助洗剂是如碳酸盐、碳酸氢盐、倍半碳酸盐、硅酸盐、铝酸盐、草酸盐以及脂肪酸,尤其是如碱金属盐(例如,钠或钾)等材料。

  任选的助洗剂的实例包括柠檬酸钠、柠檬酸、醇胺例如单、二或三乙醇胺(MEA、DEA或TEA)、碳酸钠(沉淀,log KCa=7.8)、碳酸氢钠以及氨基-三-(亚甲基-膦酸)(AMP)。

  表面活性剂

  该液体组合物实质上不含阴离子型表面活性剂,即按重量计低于1%或低于0.5%。

  该液体组合物可以实质上不含任何表面活性剂,或它可以包括非离子型表面活性剂,其量典型地按重量计低于5%。实例包括基于环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物(例如来自BASF的PluronicTM)、脂肪醇乙氧基化物(例如来自BASF的LutensolTM)以及醇烷氧基化物(例如来自BASF的PlurafacTM)。

  其他非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA),烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯),烷基酚乙氧基化物(APE),壬基酚乙氧基化物(NPE),烷基多糖苷(APG),烷氧基化胺,脂肪酸单乙醇酰胺(FAM),脂肪酸二乙醇酰胺(FADA),乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM),丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM),多羟基烷基脂肪酸酰胺,或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA),或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA)),甲酯乙氧基化物(MEE),连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品,及其组合。

  量值

  该枯草杆菌蛋白酶和该任选的第二酶各自能以从0.0001%(w/w)至5%(w/w)范围内的量值存在于该液体洗涤剂中。典型的量值是在按该液体洗涤剂组合物的重量计从0.01%至2%的范围内。

  该肽醛(或亚硫酸氢盐加合物)与该蛋白酶的摩尔比可以是至少1:1或1.5:1,并且它可以小于1000:1,更优选小于500:1,甚至更优选从100:1至2:1或从20:1至2:1,或最优选,摩尔比是从10:1至2:1。

  该强螯合助洗剂可以按重量计以0.1%以上,尤其是0.3%以上、1%以上、5%以上、10%以上、15%以上或20%以上的量存在于该液体组合物中。该量值可以是20%以下、15%以下、10以下、5%以下或2%以下。

  该含磷助洗剂可以对应于按该组合物的重量计至少0.1%,尤其是按重量计1%以上、2%以上、3%以上、4%以上或5%以上的磷含量的量存在于该液体组合物中。该量值可以对应于8%以下,尤其是6%以下、2%以下、1%以下或0.5%以下的磷含量。

  漂白系统

  该液体(餐具清洗洗涤剂)组合物可以包含按重量计0-30%,例如约1%至约20%的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠、过硼酸钠和过氧化氢―尿素(1:1)、预成型过酸及其混合物。适合的预成型过酸包括但不限于过氧羧酸及盐,二过氧二羧酸,过亚氨酸(perimidic acid)及盐,过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统,这些系统可以包括例如一种与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐,包括碱金属盐,如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在此意指一种与过氧化氢反应以经由过水解反应形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS或DOBA)、4-(壬酰基氧基)苯-1-磺酸盐(NOBS)和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点,它是环境友好的。此外,乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在存储时在产品中具有良好的水解稳定性,并且是有效的漂白活化剂。最后,ATC是多功能的,因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。可替代地,漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸,例如6-(邻苯二甲酰亚胺基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括一种漂白催化剂。在一些实施例中,漂白组分可以是选自下组的有机催化剂,该组由以下各项组成:具有下式的有机催化剂:

  

  (iii)及其混合物,

  其中每个R1独立地是含有从9到24个碳的支链烷基或含有从11到24个碳的直链烷基,优选地每个R1独立地是含有从9到18个碳的支链烷基或含有从11到18个碳的直链烷基,更优选地每个R1独立地选自下组,该组由以下各项组成:2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO2007/087259、EP 1867708(维生素K)以及WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌或酞菁铝。

  优选地,除了漂白催化剂、特别是有机漂白催化剂以外,漂白组分还包括过酸源。过酸源可选自(a)预形成的过酸;(b)过碳酸盐、过硼酸盐或过碳酸盐(过氧化氢源),优选与一种漂白活化剂组合;以及(c)过水解酶以及酯,用于在纺织品或硬表面处理步骤中在水的存在下原位形成过酸。

  其他成分

  为了溶解表面活性剂和其他洗涤剂成分,需要一个溶剂系统。溶剂典型地是水、醇、多元醇、糖和/或其混合物。优选的溶剂是水、甘油、山梨醇、丙二醇(MPG、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇)、二丙二醇(DPG)、聚乙二醇家族(PEG300-600)、己二醇、肌醇、甘露醇、乙醇、异丙醇、正丁氧基丙氧丙醇、乙醇胺(单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺)、蔗糖、右旋糖、葡萄糖、核糖、木糖以及相关的单和二吡喃糖苷和呋喃糖苷。

  该溶剂系统典型地按重量计以全部地5%-90%、5%-60%、5%-40%、10%-30%存在。包在PVA膜中的单位剂量的含水量典型地在1%-15%、2%-12%、3%-10%、5%-10%的范围内。

  包在PVA膜中的单位剂量的多元醇含量典型地在5%-50%、10%-40%或20%-30%的范围内。

  该液体组合物可以包括一种增稠剂,例如聚丙烯酸酯、多糖或多糖衍生物类型(包括果胶、海藻酸盐、阿拉伯半乳聚糖(阿拉伯树胶)、角叉菜胶、吉兰糖胶、黄原胶以及瓜尔胶),例如按重量计以0.1%至约10%,优选从约0.3%至约8%,最优选从约0.5%至约5%的量。

  该液体组合物还可以包括这样一种助水溶剂,它是将疏水化合物溶解于水溶液中(或相反地,将极性物质溶剂于非极性环境中)的化合物。典型地,助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性),然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集,参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)的综述(2007),胶体&界面科学新见(Current Opinion in Colloid&Interface Science),12:121-128。助水溶剂并不显示一个临界浓度,高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。很多助水溶剂反而示出一个连续型聚集过程,其中聚集体的大小随着浓度增加而增长。然而,很多助水溶剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂和聚合物的混合物)的相行为、稳定性和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象,例如相分离或高粘度。洗涤剂可以包含按重量计0-10%,例如按重量计0-5%,例如约0.5%至约5%、或约3%至约5%的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。

  液体组合物

  本发明的液体组合物具有一种物理形式,它不是固体(或气体)。它可以是一种可倾流的液体,一种可倾流的凝胶或一种不可倾流的凝胶。它可以是各向同性的或结构性的,优选各向同性的。它可以是一种液体洗涤剂,用于在自动洗衣机中洗涤。

  在一个实施例中,本发明针对液体餐具清洗或ADW(自动餐具清洗)洗涤剂组合物。另外的洗涤剂组分的选择在业内人士的技术内并且包括常规成分,包括以上及以下列出的示例性的非限制性组分。

  该液体组合物可以被包含在一种单位剂量产品中。单位剂量产品是不可重复使用的容器中的单一剂量的包装。它被越来越多地用于洗衣和餐具洗涤的洗涤剂中。洗涤剂单位剂量产品是在单次洗涤中所用的洗涤剂量值的包装(例如,在由水溶性膜制成的洗涤剂袋中)。

  洗涤剂袋可以被配置为单个或多个隔室(参见,例如,WO 2009/098660或WO 2010/141301)。它可以具有适合保存该洗涤剂组合物的任何形式、形状和材料,例如在与水接触之前,不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积(洗涤剂组合物)的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为袋的隔室。该袋可以包括由水溶性膜分开的固体衣物清洁(洗涤剂)组合物或其选择的组分和/或液体清洁组合物或其选择的组分。该袋可以包括具有固体和液体的任何组合的隔室,两者都在一个或多个分开的隔室中,并且在同时包含固体和液体成分的共用隔室中。该袋可以包括由不同水溶性膜形成的区域或隔室,这些膜可以含或不含酶。因此,可以在不同的隔室中将洗涤剂成分用物理方法彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的储存相互作用。在洗涤溶液中,每个隔室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。

  组合物、方法以及用途

  如以上段落中所述,本发明提供了一种液体(餐具清洗洗涤剂)组合物,包括:

  a)一种强螯合助洗剂,

  b)一种枯草杆菌蛋白酶,以及

  c)一种枯草杆菌蛋白酶抑制剂,该抑制剂是一种肽醛或其亚硫酸氢盐加合物或一种肽甲基酮,其中该甲基可任选地被卤素取代,并且其中该肽可任选地具有一个N端保护基团;

  其中该组合物实质上不含阴离子型表面活性剂。

  在一个实施例中,该组合物具有按重量计低于5%的含量的非离子型表面活性剂。

  在一个实施例中,该组合物包括按重量计高于0.1%的量的强螯合助洗剂。

  在一个实施例中,该强螯合助洗剂是一种含磷助洗剂。优选地,该组合物包括对应于按该组合物的重量计至少0.1%,尤其是按重量计1%以上、2%以上、3%以上、4%以上或5%以上的磷含量的量的含磷助洗剂。

  在一个实施例中,该组合物进一步包括一种选自下组的另外的酶,该组由以下各项组成:脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、过水解酶、漆酶、过氧化物酶以及卤代过氧化物酶。优选地,该另外的酶是一种淀粉酶。

  在一个实施例中,该组合物的抑制剂是一种具有式P-(A)y-L-(B)x-B0-R*的醛或酮或这种醛的亚硫酸氢盐加合物,其中:

  a)R*是H(氢)、CH3、CX3、CHX2或CH2X;

  b)X是卤素原子;

  c)B0是具有式-NH-CH(R)-C(=O)-的L-或D-构型的单一氨基酸残基;

  d)x是1、2或3;

  e)Bx独立地是各自经由其C端连接到下一个B或B0上的单一氨基酸残基;

  f)L不存在或独立地是具有式-C(=O)-、-C(=O)-C(=O)-、-C(=S)-、-C(=S)-C(=S)-或-C(=S)-C(=O)-的连接基团;

  g)A不存在(如果L不存在)或独立地是经由氨基酸的N端连接到L上的单一氨基酸残基;

  h)P选自下组,该组由以下各项组成:氢或(如果L不存在)一种N端保护基团;

  i)y是0、1或2,

  j)R独立地选自下组,该组由以下各项组成:任选地被一个或多个相同或不同的取代基R'取代的C1-6烷基、C6-10芳基或C7-10芳烷基;

  k)R’独立地选自下组,该组由以下各项组成:卤素、-OH、-OR”、-SH、-SR”、-NH2、-NHR”、-NR”2、-CO2H、-CONH2、-CONHR”、-CONR”2、-NHC(=N)NH2;并且

  l)R”是一个C1-6烷基。

  m)x可以是1、2或3。

  优选地,该抑制剂是一种具有式P-B2-B1-B0-H的醛或一种具有式P-B2-B1-N(H)-CHR-CHOH-SO3M的加合物,其中

  a)H是氢;

  b)B0是具有式-NH-CH(R)-C(=O)-的L-或D-构型的单一氨基酸残基;

  c)B1和B2独立地是单一氨基酸残基;

  d)R独立地选自下组,该组由以下各项组成:任选地被一个或多个相同或不同的取代基R'取代的C1-6烷基、C6-10芳基或C7-10芳烷基;

  e)R’独立地选自下组,该组由以下各项组成:卤素、-OH、-OR”、-SH、-SR”、-NH2、-NHR”、-NR”2、-CO2H、-CONH2、-CONHR”、-CONR”2、-NHC(=N)NH2;

  f)R”是一个C1-6烷基;并且

  g)P是一个N端保护基团。

  在一个实施例中,R是这样的,使得B0=-NH-CH(R)-C(=O)-是Phe、Tyr或Leu。

  在一个实施例中,B1是Ala、Gly或Val。

  在一个实施例中,B2是Arg、Phe、Tyr或Trp。

  在一个实施例中,x=2,L不存在,A不存在,并且P是对甲氧羰基(Moc)或苄氧羰基(Cbz)。

  在一个实施例中,该组合物的抑制剂是Cbz-Arg-Ala-Tyr-H、Ac-Gly-Ala-Tyr-H、Cbz-Gly-Ala-Tyr-H、Cbz-Gly-Ala-Tyr-CF3、Cbz-Gly-Ala-Leu-H、Cbz-Val-Ala-Leu-H、Cbz-Val-Ala-Leu-CF3、Moc-Val-Ala-Leu-CF3、Cbz-Gly-Ala-Phe-H、Cbz-Gly-Ala-Phe-CF3、Cbz-Gly-Ala-Val-H、Cbz-Gly-Gly-Tyr-H、Cbz-Gly-Gly-Phe-H、Cbz-Arg-Val-Tyr-H、Cbz-Leu-Val-Tyr-H、Ac-Leu-Gly-Ala-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Tyr-H、Ac-Tyr-Gly-Ala-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Leu-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Phe-H、Ac-Phe-Gly-Val-Tyr-H、Ac-Phe-Gly-Ala-Met-H、Ac-Trp-Leu-Val-Tyr-H、MeO-CO-Val-Ala-Leu-H、MeNCO-Val-Ala-Leu-H、MeO-CO-Phe-Gly-Ala-Leu-H、MeO-CO-Phe-Gly-Ala-Phe-H、MeSO2-Phe-Gly-Ala-Leu-H、MeSO2-Val-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Val-Ala-Leu-H、EtSO2-Phe-Gly-Ala-Leu-H、PhCH2SO2-Val-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Leu-Ala-Leu-H、PhCH2O-P(OH)(O)-Phe-Ala-Leu-H、或MeO-P(OH)(O)-Leu-Gly-Ala-Leu-H或任何这些的亚硫酸氢盐加合物,其中Cbz是苄氧羰基并且Moc是甲氧羰基。优选地,该抑制剂是Cbz-Gly-Ala-Tyr-H或Moc-Val-Ala-Leu-H、或其亚硫酸氢盐加合物,其中Cbz是苄氧羰基并且Moc是甲氧羰基。最优选地,该抑制剂是Cbz-Gly-Ala-Tyr-H、或其亚硫酸氢盐加合物,其中Cbz是苄氧羰基。

  在一个实施例中,该组合物的强助洗剂是三聚磷酸盐、乙二胺四乙酸、有机膦酸盐或焦磷酸盐,尤其是如碱金属盐。

  在一个实施例中,该组合物的抑制剂和枯草杆菌蛋白酶以至少为1:1的摩尔比存在。

  在一个实施例中,该组合物的枯草杆菌蛋白酶具有以下氨基酸序列,其与SEQ IDNO:1具有至少80%序列一致性,优选地至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。

  在一个实施例中,该组合物的枯草杆菌蛋白酶具有以下氨基酸序列,其与SEQ IDNO:4具有至少80%序列一致性,优选地至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。

  在又另一个实施例中,该组合物的枯草杆菌蛋白酶与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4相比具有多达10个氨基酸变化,多达9个、多达8个、多达7个、多达6个、多达5个、多达4个、多达4个、多达2个或多达1个氨基酸变化。

  在另一方面,本发明还提供了一种用于稳定一种液体(餐具清洗洗涤剂)组合物中的枯草杆菌蛋白酶的方法,该方法包括混合上述液体组合物的这些成分。

  本发明还提供了以上组合物和方法用于改善枯草杆菌蛋白酶的储存稳定性,和/或包括在该液体组合物中的另一种另外的酶的储存稳定性的用途。该另外的酶描述于以上段落“任选的另外的酶”中。该抑制剂降低了枯草杆菌蛋白酶活性,并且因此其他另外的酶的蛋白水解降解降低,而储存稳定性得到改善。

  该液体组合物的pH可以在6.0-11的范围内;尤其是在6.0-10的范围内;尤其是在6.5-9.5之间;或在7-9之间。pH可以在该组合物中直接测量或在水中的5%溶液中测量。

  实例

  用作缓沖液和底物的化学品至少是试剂等级的商品。下文实例中所用的蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3和蛋白酶4是枯草杆菌蛋白酶。蛋白酶1具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列(枯草杆菌蛋白酶309)。蛋白酶2具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列(枯草杆菌蛋白酶309变体)。蛋白酶3具有SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列(枯草杆菌蛋白酶309变体)。蛋白酶4具有SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列(枯草杆菌蛋白酶BPN’)。

  实例1

  产生一种纯度>80%的肽醛亚硫酸氢盐加合物XB1-NH-CHR-CHOH-SO3Na,其中X=Cbz-Gly;B1=Ala;R=-CH2-p(C6H4)-OH。这是Cbz-Gly-Ala-Tyr-H的亚硫酸氢盐加合物。

  将上述肽醛亚硫酸氢盐加合物溶解于40%丙二醇中并添加水以制备24%w/w的加合物溶液。制备三种不同的标准液体餐具清洗洗涤剂用于测试肽醛衍生的抑制剂,表示强螯合助洗剂的三个不同的水平。

  表2.液体洗涤剂组合物。

  

  磷含量(P-含量)通过标准的理论方法进行计算,例如,对于具有依替膦酸(HEDP)作为唯一含磷组分的洗涤剂B:

  

  向洗涤剂基质中添加以下量的酶和抑制剂(上述肽醛亚硫酸氢盐加合物),将所有样品标准化至100g的洗涤剂。将量以mg计的抑制剂作为纯的组分给出(从24%溶液中添加)。以每克酶溶液0.04g活性酶蛋白的浓度使用蛋白酶2和蛋白酶3。摩尔比表示抑制剂相对于酶的摩尔比。

  表3.

  

  

  将这些洗涤剂在37℃的密闭玻璃容器中放置2周。使用标准酶分析方法测量蛋白酶的残余活性(通过与储存在-18℃下的参照比较)(通过在40℃,pH=8.3下N,N-二甲基酪蛋白的水解测量蛋白酶活性)。

  表4.

  

  这些结果证实增加量的强螯合助洗剂趋向于使得枯草杆菌蛋白酶不稳定,并且该肽醛亚硫酸氢盐加合物特别有效地稳定在包括含磷助洗剂盐的液体配制品中的枯草杆菌蛋白酶。

  实例2

  产生不同的肽醛,所有纯度都>80%。在使用之前,将这些肽醛溶解于DMSO中至10mg/ml的浓度。

  向来自实例1的洗涤剂A中添加以下量的酶和不同抑制剂(肽醛),将所有样品标准化至100g的洗涤剂。将量以mg计的抑制剂作为纯的组分给出(从10mg/mL溶液中添加)。使用三种枯草杆菌蛋白酶:蛋白酶1、蛋白酶2和蛋白酶4,均以每克酶溶液0.04g活性酶蛋白的浓度。

  表5.

  

  

  将这些洗涤剂在37℃的密闭玻璃容器中放置2周。使用标准酶分析方法测量蛋白酶的残余活性(通过与储存在-18℃下的参照比较)(通过在40℃,pH=8.3下N,N-二甲基酪蛋白的水解测量蛋白酶活性)。

  表6.

  这些结果证实肽醛有效地稳定在包括一种强螯合助洗剂的液体配制品中的枯草杆菌蛋白酶。

  序列表

  <110> 诺维信公司

  <120> 具有稳定的枯草杆菌蛋白酶的液体自动餐具清洗洗涤剂组合物

  <130> 12559-WO-PCD

  <160> 4

  <170> PatentIn 版本 3.5

  <210> 1

  <211> 269

  <212> PRT

  <213> 迟缓芽孢杆菌

  <400> 1

  Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

  1 5 1015

  His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

  202530

  Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

  354045

  Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

  505560

  His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

  65707580

  Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

  859095

  Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

  100 105 110

  Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

  115 120 125

  Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

  130 135 140

  Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

  145 150 155 160

  Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

  165 170 175

  Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

  180 185 190

  Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

  195 200 205

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  <210> 2

  <211> 270

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  <220>

  <223> SEQ ID NO: 1的变体

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  <212> PRT

  <213> 人工

  <220>

  <223> SEQ ID NO: 1的变体

  <400> 3

  Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

  1 5 1015

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  <210> 4

  <211> 275

  <212> PRT

  <213> 人工

  <220>

  <223> BPN' 变体

  <400> 4

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  1 5 1015

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  202530

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  180 185 190

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  195 200 205

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  210 215 220

  Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn

  225 230 235 240

  Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys

  245 250 255

  Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

  260 265 270

  Ala Ala Gln

  275

《具有稳定的枯草杆菌蛋白酶的液体自动餐具清洗洗涤剂组合物.doc》
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